利用XistTale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs方法及用途技术

本发明专利技术公开了一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6‑MEFs的方法及新型动物细胞系R6‑MEFs的用途。R6‑MEFs是介于野生型MEFs和小鼠多能性干细胞系之间的、可传50代次以上的一种具有自我更新能力的新型动物细胞系；这种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型细胞系的方法可推广到人、大鼠和其他实验动物。新型动物细胞系R6‑MEFs的细胞特性为癌症研究及治疗、干细胞诱导研究和动物育种模型的建立提供了新材料和新思路。

Preparation and application of new animal cell line R6-MEFs using XistTale inhibitory transcription factor R6

The invention discloses a method for preparing a new animal cell line R6_MEFs by using Xist Tale inhibitory transcription factor R6 and the use of the new animal cell line R6_MEFs. R6_MEFs is a new animal cell line with self-renewal ability, which can be passed on more than 50 generations between wild-type MEFs and mouse pluripotent stem cell lines. This method of preparing new cell lines using Xist Tale inhibitory transcription factor R6 can be extended to human, rat and other experimental animals. The cell characteristics of the new animal cell line R6_MEFs provide new materials and ideas for cancer research and treatment, stem cell induction research and animal breeding model establishment.

【技术实现步骤摘要】
利用XistTale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs方法及用途
本专利技术属生物
，涉及一种利用结合Xist第一内含子区的Tale抑制性转录因子制备新型动物细胞系(R6-MEFs)的方法及新型动物细胞系R6-MEFs的用途。
技术介绍
Xist(X-inactivation-specifictranscript)是真哺乳亚纲动物雌性细胞中X染色体失活所必需的一种长链非编码RNA(lncRNA)。在X染色体失活的过程中，Xist扮演了一个重要的角色，它连同另外两个RNA基因(Jpx和Ftx)和两个蛋白质基因(Tsx和Cnbp2)组成了X染色体失活中心(XIC的英文全称Xchromosomeinactivationcentre，XIC)。在雌性哺乳类细胞中，Xist在失活X染色体上表达量上调，在失活染色体上起到较为关键的作用，对于调控X染色体失活起到了巨大的作用。X染色体失活发生在雌性哺乳动物中的早期胚胎发育阶段，其转录沉默一对X染色体中的一个，从而提供雄性和雌性之间的剂量等价，即剂量补偿效应。Xist在细胞重编程中发挥作用主要是通过转录成的XistRNA缠绕将要失活的X染色体并使其沉默。被包裹的X染色体启动一系列的失活路径，包括启动DNA甲基化、组蛋白修饰等生物学反应，实现X染色体的失活。同时，一旦失活的X染色体需要进行重活化时，XistRNA的转录水平则会受到抑制，以便于失活X染色体的重活化。Xist在多能干细胞中的表达沉默，与多能性因子OCT4，SOX2和NANOG有着重要的关系。在胚胎干细胞中，多能性调控因子OCT4、SOX2和NANOG等结合到Xist第一内含子区，以调控和维持XistRNA的低水平状态。最近研究发现，在Xist第一内含子区结合的因子还包括多能性调控因子TCF3和PRDM14，以及早期胚胎发育调控因子CDX2等。此外，多能性因子出现直接与Xist调节相关，在Nanog缺失或Oct4的诱导阻遏时，Xist被上调，并且多能性因子对第一内含子的结合功能丧失。类转录激活效应物(Transcriptional-activator-likeeffectors,TALEs)蛋白家族是来自于植物病原体-黄单胞杆菌的天然细菌效应蛋白。它与真核生物的转录因子相似，通过识别特异DNA序列来调节宿主基因转录，并促进细菌定植。人工体外合成的TALEs蛋白已经运用到基因工程的多个方面，包含具有基因组剪辑作用的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和起基因转录修饰和调控作用的Tale-dTFs等，其中Tale-dTFs包含抑制性效应因子(TALEbaseddesignertranscriptionRepressors,TaleR-dTF)和激活性效应因子(TALEbaseddesignertranscriptionactivators,TaleA-dTF)，它们的TALE蛋白分别与抑制结构域(如KRAB等)和激活结构域(如VP64)相连接，最终通过在结合位点募集各种不同的转录调控因子而达到改变结合位点的表观遗传修饰状态并调控靶基因开关的目的。而且，Tale-dTFs已成功地应用于MEF细胞的重编程及干细胞的分化、转分化实验中。而结合于Xist第一内含子区的基于类转录激活效应物的抑制性体外转录因子(Transcriptional-activator-likeeffectorsbaseddesignerTranscriptionFactors,Tale-dTFs)Repressor6(以下称R6)显著提高了小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast,MEF)向iPSC的诱导效率。因此，利用结合于Xist第一内含子的Tale抑制性转录因子R6建立新型动物细胞系成为可能。
技术实现思路
本专利技术提供一种利用XistTale抑制性转录因子制备了新型动物细胞系R6-MEFs的方法，利用R6成功制备了具有自我更新能力、可传代至50次以上的新型动物细胞系R6-MEFs，该细胞的潜在特性为癌症的研究及治疗、干细胞诱导研究和动物育种模型的建立提供了新材料和新思路。本专利技术采用的技术方案是：一种利用XistTale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)载体制备及细胞建系：利用小鼠Oct4TaleR-dTF载体改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的TaleR-dTF(R6)，最终形成的R6为PB载体携带的由Doxycycline(Dox)依赖型启动子TRE驱动的表达载体；在体外条件下，获取携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs；2)获得新型动物细胞系R6-MEFs：A、Oct4-GFPMEFs的脂质体转染：将携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs使用M10培养液培养于六孔板中，转染30min前更换为新鲜的M15培养液2mL，放入培养箱中等待转染；携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs达到40％-60％汇合度时，将500μL转染体系加入M15培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，进行脂质体转染；B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：a、脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；b、脂质体转染后第三天荧光显微镜检测转染效率：转染成功的细胞表达红色荧光蛋白，更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞，培养细胞三天后，绝大多数非转基因细胞凋亡；c、第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时，按照1：40进行传代培养；隔天进行细胞生长情况的观察，并在液体发黄时更换M15+Dox培养液；d、细胞生长速度较快并且形成明显克隆的细胞，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存；所述M10培养液的配制如下：含有10％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素的KnockoutDMEM。所述M15培养液的配制如下：含有15％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素、0.1mMβ-巯基乙醇和106U/mlLIF的KnockoutDMEM。所述M15+Dox培养液为添加2μg/mLDoxcycline的M15培养液；所述M15+Dox+puro培养液为添加2μg/mLDoxcycline和2μg/mLpuromycin的M15培养液。所述步骤A中转染体系由250μLA液和250μLB液组成：A液组成成分包含245μL的OPTI-MEM和5μL的脂质体转染试剂Lipofectamine2000；B液组成成分包含250μL的OPTI-MEM和转染载体，A液和B液配好后分别充分混匀，于室温孵育5min；然后将A、B液混匀静置，室温孵育30min。所述转染载体为转座酶HyBase1μg，CAG-rtTA1μg，PGK-Puro1μg和携带mCherry的R6载体2μg。所述步骤A的R6载体的结合位点如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA，GeneBank中参考基因序列号：NC_000086.7；所述步骤B中利用R6建立R6-MEFs，需以低密度接种转基因细胞进行传代本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用Xist Tale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6‑MEFs的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)载体制备及细胞建系：利用小鼠Oct4Tale R‑dTF载体改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的Tale R‑dTF(R6)，最终形成的R6为PB载体携带的由Doxycycline(Dox)依赖型启动子TRE驱动的表达载体；在体外条件下，获取携带Oct4‑GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs；2)获得新型动物细胞系R6‑MEFs：A、Oct4‑GFP MEFs的脂质体转染：将携带Oct4‑GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs使用M10培养液培养于六孔板中，转染30min前更换为新鲜的M15培养液2mL，放入培养箱中等待转染；携带Oct4‑GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs达到40％‑60％汇合度时，将500μL转染体系加入M15培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，进行脂质体转染；B、脂质体转染后R6‑MEFs的诱导及建系：a、脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；b、脂质体转染后第三天荧光显微镜检测转染效率：转染成功的细胞表达红色荧光蛋白，更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞，培养细胞三天后，绝大多数非转基因细胞凋亡；c、第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时，按照1：40进行传代培养；隔天进行细胞生长情况的观察，并在液体发黄时更换M15+Dox培养液；d、细胞生长速度较快并且形成明显克隆的细胞，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存。...

【技术特征摘要】
1.一种利用XistTale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)载体制备及细胞建系：利用小鼠Oct4TaleR-dTF载体改造为特异性识别和结合Xist第一内含子区的TaleR-dTF(R6)，最终形成的R6为PB载体携带的由Doxycycline(Dox)依赖型启动子TRE驱动的表达载体；在体外条件下，获取携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs；2)获得新型动物细胞系R6-MEFs：A、Oct4-GFPMEFs的脂质体转染：将携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs使用M10培养液培养于六孔板中，转染30min前更换为新鲜的M15培养液2mL，放入培养箱中等待转染；携带Oct4-GFP基因的胎鼠成纤维细胞MEFs达到40％-60％汇合度时，将500μL转染体系加入M15培养液中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养，进行脂质体转染；B、脂质体转染后R6-MEFs的诱导及建系：a、脂质体转染后第二天将M15培养液更换为M15+Dox培养液培养，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；b、脂质体转染后第三天荧光显微镜检测转染效率：转染成功的细胞表达红色荧光蛋白，更换新的M15+Dox+puro培养液，筛选具有转基因的细胞，培养细胞三天后，绝大多数非转基因细胞凋亡；c、第六天更换为M15+Dox培养液培养，直至汇合度达到80％时，按照1：40进行传代培养；隔天进行细胞生长情况的观察，并在液体发黄时更换M15+Dox培养液；d、细胞生长速度较快并且形成明显克隆的细胞，将其单克隆传入6孔板进行建系，建系成功后按比例1：40传代和冻存。2.根据权利要求1所述的一种利用XistTale抑制性转录因子R6制备新型动物细胞系R6-MEFs的方法，其特征在于：所述M10培养液的配制如下：含有10％胎牛血清、1×谷氨酰胺、1×非必需氨基酸、1×青链霉素的KnockoutDMEM。3.根据权利要求1所述的一种利用XistTale抑制性转录因子...

【专利技术属性】
技术研发人员：张金吨，李喜和，范丽红，梁延峰，
申请(专利权)人：内蒙古赛科星家畜种业与繁育生物技术研究院有限公司，内蒙古赛科星繁育生物技术集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15