The invention provides a preparation method of CAR T cells. The method adds Akt inhibitor MK2206 to both T lymphocyte activation and lentivirus infection process, and the positive rate of CAR of the obtained CAR T cells is significantly increased, and the proportion of memory cells is significantly increased, thus delaying the final differentiation, improving its survival in vivo, and realizing in vitro detection of non-impaired killing ability. In the case of delaying differentiation and increasing the positive rate of CAR expression, the survival status of CAR T cells in vivo is better, the treatment effect is better, and it has broad application prospects and huge market value.
【技术实现步骤摘要】
一种CAR-T细胞的制备方法
本专利技术属于生物
,涉及一种CAR-T细胞的制备方法。
技术介绍
癌症是由正常细胞组成,这些细胞经历了表观遗传转化而变成异常癌细胞。癌细胞能够表达与正常细胞表达不同的蛋白质和其他抗原。这些异常的肿瘤抗原可被人体先天免疫系统用于特异性靶向和杀死癌细胞。然而,癌细胞采用各种机制来阻止免疫细胞如T和B淋巴细胞成功靶向癌细胞。人T细胞疗法依赖体外富集或修饰的人T细胞靶向和杀死受试者中的癌细胞。目前医学领域已经开发了各种技术来富集能够靶向肿瘤抗原的天然存在的T细胞的浓度或者遗传修饰T细胞以特异性靶向已知的癌症抗原。已证实这些疗法对肿瘤大小和患者存活具有有希望的效果。然而,难以预测给定的T细胞疗法是否会对每位患都者有效。嵌合抗原受体T细胞疗法的出现是免疫治疗领域的一大突破性进展。CAR-T疗法是利用患者自身免疫细胞杀伤肿瘤细胞,是一种特异性杀伤肿瘤细胞的方法,该治疗方法通过提取患者外周血中的T淋巴细胞,再将提取的T淋巴细胞通过基因工程方法进行改造,改造后的T淋巴细胞具备强大的特异性识别肿瘤抗原的能力。然而用于治疗剂量的CAR-T细胞由于受到制备方法的限制,制备出的CAR-T细胞处于分化的终末阶段,阳性率较低,导致回输的CAR-T细胞仅仅具有短期的效果,CAR-T细胞在体内存活时间较短导致疗法缺乏延续性。既往的CAR-T细胞制备方法产生易于耗竭且疗效的细胞产物。现今对于改善CAR-T细胞的制备方法存在改善空间。因此,研发一种优化的CAR-T细胞的制备方法,提升CAR阳性率,延缓T细胞的终末分化,改善体内存活情况,具有广阔的应用前景和 ...
【技术保护点】
1.一种CAR‑T细胞的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)分离外周血单个核细胞,得到T淋巴细胞;(2)将步骤(1)的T淋巴细胞激活的同时加入Akt抑制剂孵育培养;(3)将包含嵌合抗原受体的慢病毒载体或慢病毒在Akt抑制剂的作用下转导或感染步骤(2)孵育培养的T淋巴细胞,得到CAR‑T细胞并进行增殖。
【技术特征摘要】
1.一种CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)分离外周血单个核细胞,得到T淋巴细胞;(2)将步骤(1)的T淋巴细胞激活的同时加入Akt抑制剂孵育培养;(3)将包含嵌合抗原受体的慢病毒载体或慢病毒在Akt抑制剂的作用下转导或感染步骤(2)孵育培养的T淋巴细胞,得到CAR-T细胞并进行增殖。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述分离的方法包括Ficoll密度梯度离心法和/或percoll分层液法,优选为Ficoll密度梯度离心法。3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述Akt抑制剂包括A6730、B2311、124018、RX-0201、VQD-002、LY294002、Akti-1、Akti-2、Akt抑制剂III、Akt抑制剂VIII或MK-2206中的任意一种或至少两种的组合,优选为MK2206。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述Akt抑制剂的浓度为0.1-2μM。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(2)所述激活的方法为加入抗体磁珠活化刺激。6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于...
【专利技术属性】
技术研发人员:张青,郑骏年,丁佳戈,
申请(专利权)人:徐州医科大学,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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