一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用。本发明专利技术基于CAR泛素化修饰原理，将CD3ζ的第64位和第66位的赖氨酸突变为精氨酸，使其缺失了被泛素化的能力，进而减少CAR内化的速率，延长了CAR在细胞膜上的半衰期，进而提高了CAR在细胞膜上的停留时间，增加了CAR

【技术实现步骤摘要】
一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用，具体为一种能够延长嵌合抗原受体在细胞膜上的半衰期的突变的CD3ζ胞内区及其在构建嵌合抗原受体骨架中的应用。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor,CAR)是一种人工合成的模拟TCR功能的T细胞受体，由胞外靶向连接区，以及T细胞的激活信号结构域组成。胞外靶向连接区由单链抗体或配体构成，具有特异性结合靶抗原的功能。T细胞的激活信号结构域包括铰链区、跨膜区、胞内信号转导区，铰链区常采用CD8、CD4或IgG4分子的铰链区。跨膜区由亲脂性的氨基酸序列组成，常采用CD8、CD28的跨膜区段。胞内信号转导区由CD3ζ链或FcεRIγ链以及共刺激信号分子CD28、CD137(4
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1BB)、CD134(OX40)、CD27、ICOS、CD244等构成。第一代CAR仅含有CD3ζ链或FcεRIγ链，第二代CAR包含1个共刺激信号分子，第三代CAR含有2个及以上共刺激信号分子。CAR修饰的T细胞通过胞外靶向连接区识别肿瘤表面抗原，在患者体内靶向性地杀伤表达相关抗原的肿瘤细胞，进而达到清除肿瘤细胞的效果。
[0003]近年来，嵌合抗原受体T淋巴细胞(CAR
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T)作为一种新兴的肿瘤免疫治疗手段，在复发/难治性恶性B细胞肿瘤的治疗中展现出了显著的治疗效果，目前，全球已有多所医疗机构注册开展了针对急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)的临床试验，通过向患者体内输注经修饰的T细胞而特异性杀伤表达相应抗原的肿瘤细胞，并取得了相对较好的治愈率。然而，CAR
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T治疗仍存在诸多的局限，例如，有研究表明治疗后完全缓解中位时间一般均在8个月左右，但仍有大量患者复发，这可能与CAR
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T细胞的CAR中的CD3ζ的赖氨酸被泛素化修饰，引发CAR全结构内化，进入细胞内被溶酶体消化降解，导致其在患者体内存留时间短有关，因此，提高CAR
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T细胞体内存留时间对于提高CAR
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T治疗的疗效具有重大意义。
[0004]目前，现有技术存在的缺陷是细胞膜上的CAR半衰期过短，导致CAR
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T细胞在体内的存留时间短，杀伤能力和持久力均不强，因此，针对现有技术存在的缺陷，本专利技术基于CAR泛素化修饰原理，将CD3ζ的第64位和第66位的赖氨酸突变为精氨酸，使其缺失了被泛素化的能力，进而减少CAR内化的速率，延长了CAR在细胞膜上的半衰期，提高了CAR在细胞膜上停留时间，增加了CAR
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T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

技术实现思路

[0005]针对目前现有技术存在的细胞膜上的CAR半衰期过短，导致CAR
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T细胞在体内的存留时间短，杀伤能力和持久力均不强等问题，本专利技术的目的在于提供一种新型嵌合抗原受体及其制备方法和应用。本专利技术基于CAR泛素化修饰原理，将CD3ζ的第64位和第66位的赖氨酸突变为精氨酸，使其缺失了被泛素化的能力，进而减少CAR内化的速率，延长了CAR在细胞膜上的半衰期，提高了CAR在细胞膜上停留时间，增加了CAR
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T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面提供了一种嵌合抗原受体。
[0008]进一步，所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；
[0009]优选地，所述胞内结构域包括依次串联的共刺激信号传导区和CD3ζ胞内区；
[0010]更优选地，所述CD3ζ胞内区为延长嵌合抗原受体在细胞膜上的半衰期的突变的CD3ζ胞内区；
[0011]最优选地，所述突变的CD3ζ胞内区为野生型CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸得到的；
[0012]最优选地，所述突变的CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0013]更优选地，所述共刺激信号传导区包括CD27、CD28、4
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1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、B7
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H3和/或其任何组合的胞内区；
[0014]最优选地，所述共刺激信号传导区为4
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1BB胞内区；
[0015]最优选地，所述4
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1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；
[0016]优选地，所述胞外结构域包括抗原识别区；
[0017]更优选地，所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原包括CD3、CD19、CD123、CD138、CD38、CD33、CD30、CD28、CD27、CD22、CD20、IL13Rα2、CTLA4、CEA、CS1、NY
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ESO
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1、MAGE A3、ROR1、Her2、PD1、BCMA、GD2；
[0018]最优选地，所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原为CD3；
[0019]最优选地，所述抗原识别区包括与CD3特异性结合的scFv；
[0020]最优选地，所述scFv由重链可变区
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Linker
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轻链可变区构成；
[0021]最优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0022]最优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0023]最优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；
[0024]更优选地，所述胞外结构域还包括信号肽和/或铰链区，形成依次串联的信号肽
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抗原识别区
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铰链区；
[0025]最优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0026]最优选地，所述铰链区包括CD8α、CD28、IgG1、IgG4、4
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1BB、PD
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1、CD34、OX40、CD3ε的铰链区；
[0027]最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；
[0028]最优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；
[0029]优选地，所述跨膜结构域包括CD4、CD8、CD8α、CD28、H2
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Kb、OX40、4
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1BB的跨膜区；
[0030]更优选地，所述跨膜结构域为CD8跨膜区；
[0031]最优选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。
[0032]进一步，形成本专利技术的嵌合抗原受体的上述各个部分，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次串联的胞外结构域、跨膜结构域、胞内结构域；优选地，所述胞内结构域包括依次串联的共刺激信号传导区和CD3ζ胞内区；更优选地，所述CD3ζ胞内区为延长嵌合抗原受体在细胞膜上的半衰期的突变的CD3ζ胞内区；最优选地，所述突变的CD3ζ胞内区为野生型CD3ζ胞内区的第64位和第66位的赖氨酸突变成精氨酸得到的；最优选地，所述突变的CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；更优选地，所述共刺激信号传导区包括CD27、CD28、4
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1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、NKG2C、B7
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H3和/或其任何组合的胞内区；最优选地，所述共刺激信号传导区为4
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1BB胞内区；最优选地，所述4
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1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；优选地，所述胞外结构域包括抗原识别区；更优选地，所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原包括CD3、CD19、CD123、CD138、CD38、CD33、CD30、CD28、CD27、CD22、CD20、IL13Rα2、CTLA4、CEA、CS1、NY
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ESO
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1、MAGE A3、ROR1、Her2、PD1、BCMA、GD2；最优选地，所述抗原识别区识别的肿瘤相关抗原为CD3；最优选地，所述抗原识别区包括与CD3特异性结合的scFv；最优选地，所述scFv由重链可变区
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Linker
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轻链可变区构成；最优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；最优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；最优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；更优选地，所述胞外结构域还包括信号肽和/或铰链区，形成依次串联的信号肽
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抗原识别区
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铰链区；最优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；最优选地，所述铰链区包括CD8α、CD28、IgG1、IgG4、4
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1BB、PD
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1、CD34、OX40、CD3ε的铰链区；最优选地，所述铰链区为CD8α铰链区；最优选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；优选地，所述跨膜结构域包括CD4、CD8、CD8α、CD28、H2
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Kb、OX40、4
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1BB的跨膜区；更优选地，所述跨膜结构域为CD8跨膜区；最优选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。2.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括权利要求1所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求2所述的核酸分子；优选地，所述表达载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、或病毒载体；更优选地，所述病毒载体包含慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体。4.一种表达权利要求1所述的嵌合抗原受体的细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要
求2所述的核酸分...

【专利技术属性】
技术研发人员：王方圆，戴卫国，朱滨，
申请(专利权)人：北京门罗生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：