一种人多能干细胞衰老模型的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物医学技术领域，提供了一种人多能干细胞衰老模型的制备方法及其应用，人多能干细胞衰老模型的制备方法为将中国突变型HGPS病人来源的外周血单核细胞重编程为中国HGPS‑iPSC；使用CRISPR/Cas9和ssODNs介导的单核苷酸突变修复技术对LMNA的c.1579C>T(p.R527C)突变进行修复；并在体外将正常iPSC、中国HGPS‑iPSC和突变纠正iPSC分别分化为功能性MSCs，检测3种iPSC‑MSC中LMNA蛋白的表达、细胞增值、凋亡、细胞周期和细胞衰老等情况，由此揭示c.1579C>T(p.R527C)突变对细胞相关通路信号分子表达功能的影响，研究区别于高加索人群突变型HGPS的中国HGPS的分子机制和致病机理。

Preparation and application of an aging model of human pluripotent stem cells

The present invention relates to the field of biomedical technology, and provides a preparation method and application of human pluripotent stem cell aging model. The preparation method of human pluripotent stem cell aging model is reprogramming peripheral blood monocytes from Chinese mutant HGPS patients into Chinese HGPS iPSC; using CRISPR/Cas9 and ssODNs-mediated single nucleotide mutation repair technology for LMNA c.1579C>T (p.R527C). Mutations were repaired; normal iPSC, Chinese HGPS iPSC and mutation-corrected iPSC were differentiated into functional MSCs in vitro, and the expression of LMNA protein, cell proliferation, apoptosis, cell cycle and cell senescence in three kinds of iPSC MSCs were detected, which revealed the effect of c.1579C > T (p.R527C) mutation on signal molecule expression of cell-related pathways. The study was different from Caucasian population. Molecular and pathogenic mechanisms of mutant HGPS in China.

【技术实现步骤摘要】
一种人多能干细胞衰老模型的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物医学
，尤其是涉及一种人多能干细胞衰老模型的制备方法及其应用。
技术介绍
儿童早老症也称为汉氏早老综合症(Hutchinson-GilfordProgeriaSyndrome，HGPS)，是一种极为罕见的先天遗传性疾病，其患者在婴儿期身体就快速老化，发病率约为百万分之一，患者一般在1岁左右就显示皮肤硬化等病症，3岁左右可见明显的衰老表型，并可出现衰老面容、皮下脂肪缺失、骨质溶解等。患者衰老速度相当于正常儿童的5-10倍，一般在十几岁以前由于加速的心血管粥样硬化导致心脑血管疾病过早死亡。目前已初步认识到HGPS患者的细胞有明显的缺陷：包括细胞核变形、衰老蛋白progerin的积累、组蛋白修饰改变和DNA损伤增多等，研究已经表明LMNA基因编码的核纤层蛋白laminA参与HGPS导致的衰老过程。大多数高加索HGPS患者的LMNA基因携带c.1824C>T(p.G608G)突变，对高加索人群的HGPS研究表明其致病机制是由于同义突变导致的异常RNA剪接参的的毒性蛋白progerin积累而致病。我们最近在中国人群中发现本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人多能干细胞衰老模型的制备方法，包括如下步骤：1)采集正常人和中国HGPS患者的外周血，体外分离并培养扩增原代外周血单核细胞PBMC；2)正常人iPSC和中国HGPS‑iPSC模型构建：包括PBMC体细胞重编程、iPSC克隆挑选和记录、iPSC的扩大培养和冻存；3)中国HGPS‑iPSC基因型鉴定和iPSC鉴定：包括HGPS‑iPSC基因型确认、分析LMNA蛋白的表达、iPSC的分子生物学鉴定；4)CRISPR/Cas9和ssODNs介导的基因编辑修复单位点突变：包括靶标于LMNA基因的gRNAs和ssODNs设计、sgRNA载体构建、CRISPR/sgRNA活性鉴定、突变纠正的iPS...

【技术特征摘要】
1.一种人多能干细胞衰老模型的制备方法，包括如下步骤：1)采集正常人和中国HGPS患者的外周血，体外分离并培养扩增原代外周血单核细胞PBMC；2)正常人iPSC和中国HGPS-iPSC模型构建：包括PBMC体细胞重编程、iPSC克隆挑选和记录、iPSC的扩大培养和冻存；3)中国HGPS-iPSC基因型鉴定和iPSC鉴定：包括HGPS-iPSC基因型确认、分析LMNA蛋白的表达、iPSC的分子生物学鉴定；4)CRISPR/Cas9和ssODNs介导的基因编辑修复单位点突变：包括靶标于LMNA基因的gRNAs和ssODNs设计、sgRNA载体构建、CRISPR/sgRNA活性鉴定、突变纠正的iPSC产生、基因编辑的iPSC克隆挑选和扩增、基因编辑的iPSC克隆的冻存和基因型鉴定；5)诱导iPSC分化为间充质干细胞(iPSC-MSC)以及表型鉴定：诱导正常iPSC、中国HGPS-iPSC和突变纠正iPSC分化为MSCs、iPSC-MSC鉴定；6)正常iPSC-MSC、中国HGPS-iPSC-MSC和突变纠正iPSC-MSC生物学特征分析：包括细胞衰老相关蛋白的表达、细胞增殖和凋亡情况、细胞功能稳定性检测、以及衰老涉及的基因和信号通路的研究。2.根据权利要求1所述的人多能干细胞衰老模型的制备方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人诱导性多能干细胞或人胚胎干细胞。3.根据权利要求1所述的人多能干细胞衰老模型的制备方法，其特征在于：所述人多能干细胞中的LMNA基因的c.1579C>T(p.R527C)纯合突变，单核苷酸错...

【专利技术属性】
技术研发人员：周焱，莫翠萍，舒伟，廖进齐，方崇州，韩倩，刘佳，周光前，
申请(专利权)人：深伦生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44