一种以食用菌分泌乙醛脱氢酶的基因工程菌制造技术

本发明专利技术公开了一种专性分泌乙醛脱氢酶的基因工程菌，所述基因工程菌是通过采用乳酸乳球菌表达人源蛋白的方式，将用于表达乙醛脱氢酶的质粒转入宿主乳酸乳球菌中得到的。本发明专利技术提供的基因工程菌能够表达乙醛脱氢酶并分泌至乳酸乳球菌的细胞外，所述乙醛脱氢酶可将乙醛催化为乙酸。本发明专利技术中所用到的菌种、质粒以及试剂均为食品级材料，可用于食品发酵加工产业，且能够增强酒精在人体中的有效代谢，其具有在解酒食品和保健品方面影响深远的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种以食用菌分泌乙醛脱氢酶的基因工程菌
本专利技术涉及基因重组领域和酶工程领域，尤其涉及分泌乙醛脱氢酶基因工程菌在解酒食品和保健品方面的应用。
技术介绍
摄入大量酒精使神经系统从兴奋到高度的抑制，严重地破坏人体神经系统的正常功能。酒精在人体中的代谢主要依靠肝脏中乙醇脱氢酶（Alcoholdehydrogenase,ADH）和乙醛脱氢酶（Acetaldehydedehydrogenase,ALDH）的催化代谢。酒精摄入人体后，经由口腔、食道、胃、肠道的各处黏膜快速吸收进入血液，循环至肝脏进行代谢。当人体能够充分表达这两种脱氢酶时，乙醇被迅速氧化为乙醛，紧接着乙醛被迅速氧化为乙酸，随之被代谢排出，减少了酒精对中枢神经的破坏。一般情况下人的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶可以充分表达，而乙醛脱氢酶单碱基突变的等位基因翻译出的酶中，残基487的谷氨酸变为赖氨酸，造成催化活性基本丧失。这种乙醛脱氢酶的单碱基突变基本出现在亚洲人的基因中，使已经代谢生成的乙醛不能及时代谢成为乙酸，造成了被称为“酒精中毒”的乙醛中毒。近年来已有很多成功表达出乙醛脱氢酶的案例，但是由于服用的乙醛脱氢酶制剂并不会使其通过血液进入肝脏进行乙醛代谢，所以我们希望设计出一种食品级乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的微生物混合制剂，使酒精在胃肠道中就被大量代谢，减少酒精对肝脏和中枢神经的损伤。所以，乙醛脱氢酶产品的食品工业化具有重要的应用价值。
技术实现思路
因此，本专利技术第一个目的是提供一种通过基因工程技术获得的高产乙醛脱氢酶的乳酸乳球菌基因工程菌株LactococcuslactisNZ3900-pNZ8149-sig-ALDH2，保藏号为CCTCCNo：M2019091，保藏日期为2019年1月29日，保藏单位是中国典型培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心。本专利技术的第二个目的是提供一种增强人体胃肠道内酒精代谢的食品级基因工程菌，在于提供编码分泌型乙醛脱氢酶的基因工程菌，其中分泌型乙醛脱氢酶的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。本专利技术的第三个目的是提供携带所述基因的载体和宿主细胞系。本专利技术的第四个目的是提供一种乳酸乳球菌基因工程菌，是表达所述分泌型乙醛脱氢酶基因的乳酸乳球菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述的乳酸乳球菌是以乳酸乳球菌LactococcuslactisNZ3900为宿主，以pNZ8149为表达载体表达分泌型乙醛脱氢酶的基因。本专利技术的第五个目的是提供一种产乙醛脱氢酶基因工程菌的生产方法，是将所述工程菌接种至M17肉汤培养基中，25-37℃培养8-36小时。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基中应添加终浓度为0.1-100ng/ml的乳酸链球菌素（nisin），以诱导启动子开始表达乙醛脱氢酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基中应添加含有Zn2+终浓度为0.05-1g/ml的葡萄糖酸锌溶液，以提供乙醛脱氢酶活性所需的锌离子。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基中应添加氧化型辅酶I（NAD+），其使用浓度为0.1-50mmol/L，以提供乙醛脱氢酶催化反应所需要的氢受体（氢负离子，:H-）。本专利技术的第六个目的是提供所述基因在制备含乙醛脱氢酶的产品中的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述产品应包括食品、保健品。技术效果：本专利技术提供了一种能够高效表达并分泌乙醛脱氢酶基因的工程菌及其构建方法。通过分子生物学技术使本专利技术实现了乙醛脱氢酶在乳酸乳球菌中的大量表达，且能够使表达产物乙醛脱氢酶分泌至乳酸菌外。本专利技术中所使用到的菌种和质粒均为不含抗生素筛选的食品级材料，而且诱导乙醛脱氢酶表达的诱导物nisin也是目前世界上唯一被允许用作食品添加剂的细菌素。最后，在能够分泌乙醛脱氢酶的乳酸乳球菌培养液中添加葡萄糖酸锌溶液，以提供乙醛脱氢酶所需的辅酶锌离子（Zn2+），并添加作为氢离子受体的氧化型辅酶I（NAD+）使乙醛脱氢酶具有良好的生物活性。为解酒食品和保健品的研发提供了有效的理论基础和应用技术。附图说明图1乙醛脱氢酶重组质粒构建示意图。图2为乙醛脱氢酶重组质粒pNZ8149-sig-ALDH2的酶切验证图。图3为重组乳酸乳球菌乙醛脱氢酶的蛋白SDS-PAGE凝胶电泳图。具体实施方式本专利技术提供了用于人体胃肠道内酒精代谢的基因工程菌，为使本专利技术的目的、技术方案更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。实施例1人工合成SEQIDNO.1所示的分泌型乙醛脱氢酶基因（sig-ALDH2），通过限制性内切酶NcoI和SpeI将目的基因片段和pNZ8149载体片段双酶切，并用T4连接酶连接得到重组质粒；将所述重组质粒电转化至乳酸乳球菌NZ3900表达菌株中，用M17肉汤标准培养基（含乳糖）进行筛选，挑取阳性克隆，提取质粒酶切验证（图2）或测序验证，得到所述用于表达分泌型乙醛脱氢酶的基因工程菌。实施例2将实施例1中得到的重组基因工程菌接种于M17肉汤标准培养基（固体），于30℃进行菌种活化。将所述活化菌株接种于M17肉汤标准培养基（液体），30℃、180rpm，培养8-36小时用以制备种子菌液。分别取活化的种子液2ml加入200ml的M17肉汤标准培养基中，在30℃、180rpm，培养至OD600≈0.5时，加入nisin溶液使终浓度至25ng/ml，开始诱导重组基因工程菌表达目的蛋白。得到所述乙醛脱氢酶的氨基酸序列为SEQIDNO.2。实施例3对所述实施例1的重组基因工程菌进行外源蛋白表达量的测定，以nisin诱导前作为对照，所述乙醛脱氢酶的蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳图，如图3所示。应当理解的是，本专利技术的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有的这些改进和变换都应属于本专利技术所附权利要求的保护范围。序列表<110>深伦生物科技（深圳）有限公司<120>一种以食用菌分泌乙醛脱氢酶的基因工程菌<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>1697<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<400>1ccatggggaggaaaaattaaaaaagaacagttatgaaaaaaaagattatctcagctattt60taatgtctacagtgatactttctgctgcagccccgttgtcaggtgtttacgctgcatgca120tgttgcgcgctgccgcccgcttcgggccccgcctgggccgccgcctcttgtcagccgccg180本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于增强人体胃肠道内酒精代谢的食品级基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为

【技术特征摘要】
1.一种用于增强人体胃肠道内酒精代谢的食品级基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为LactococcuslactisNZ3900-pNZ8149-sig-ALDH2，2019年1月29日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，其保藏号为CCTCCNo：M2019091。


2.根据权利要求1所述用于酒精代谢的食品级基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将用于表达分泌型乙醛脱氢酶的基因片段转入乳酸乳球菌NZ3900菌株得到的，所述表达分泌型乙醛脱氢酶的基因片段为SEQIDNO.1中的核苷酸序列。


3.根据权利要求2所述的用于酒精代谢的食品级基因工程菌，其特征在于，构建时将SEQIDNO.1中的核苷酸序列与表达载体pNZ8149通过酶切位点NcoI和SpeI连接得到重组表达载体pNZ8149-sig-ALDH2，将所述重组表达载体转化至宿主菌中，得到所述用于酒精代谢的基因工程菌。


4.根据权利要求2所述用于酒精代谢的基因工程菌，其特征在于，所述表达分泌型乙醛脱氢酶基因的片段中还包括核糖体结合位点（RBS）和用于表达信号肽（Signa...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩倩，李明，莫翠萍，方崇洲，周华涛，周海，周光前，
申请(专利权)人：深伦生物科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44