一种体外重建的人红细胞代用品及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种体外重建的人红细胞代用品及其制备方法，采用低渗法进行体外重建，在低渗环境(富含血红蛋白)下，膜载体上出现暂时性的孔径，膜载体内外的血红蛋白浓度差使得血红蛋白通过暂时性孔径进入载体内，随后，膜上的暂时性孔径会因细胞膜的流动性而再次密封，包裹住进入的血红蛋白。之后，用酶标仪检测重建人红细胞的血红蛋白相对加载率；用相差显微镜观察重建人红细胞的形态大小；用血氧分析仪检测重建人红细胞的携氧功能。本发明专利技术能降低由免疫原性引起的一系列输血后反应，应用于临床急救等。在加载用的血红蛋白液中添加适量2，3‑DPG和ATP等以调节重建红细胞的携氧功能，从而在提高缺血缺氧患者血容量的同时改善患者体内缺氧状态。

A human erythrocyte substitute for in vitro reconstruction and its preparation method

The present invention discloses an in vitro reconstructed human erythrocyte substitute and its preparation method. It is reconstructed in vitro by hypoosmotic method. Under hypoosmotic environment (rich in hemoglobin), temporary pore size appears on the membrane carrier. The difference of hemoglobin concentration inside and outside the membrane carrier causes hemoglobin to enter the carrier through temporary pore size. Subsequently, the temporary pore size on the membrane will be caused by the flow of cell membrane. Dynamic and re-sealed, encapsulating the incoming hemoglobin. After that, the relative loading rate of hemoglobin in reconstructed human red blood cells was measured by enzyme labeling instrument, the shape and size of reconstructed human red blood cells were observed by phase contrast microscope, and the oxygen carrying capacity of reconstructed human red blood cells was measured by oxygen analyzer. The invention can reduce a series of post-transfusion reactions caused by immunogenicity, and can be applied to clinical first aid, etc. Adding appropriate amount of 2,3 DPG and ATP to the loaded hemoglobin solution can regulate the oxygen carrying function of the reconstructed red blood cells, so as to improve the blood volume of ischemic and hypoxic patients as well as the hypoxic status in vivo.

【技术实现步骤摘要】
一种体外重建的人红细胞代用品及其制备方法
本专利技术涉及红细胞代用品领域，具体是一种体外重建的人红细胞代用品及其制备方法。
技术介绍
近年来，全世界范围内临床用血量迅速增加，频繁出现的血荒使得血液短缺已达到危机的程度。此外，在突发重大自然灾害、战争和恐怖事件等一系列特殊环境下，大批伤员需要同时输血治疗时将导致这一供求矛盾急剧增加。据估计，即使和平时期，全世界每年约需要1500万升新鲜血液，而且还呈明显增长趋势。我国每年医疗用血量近130万升，每年还以7～9％的速度递增。同时，常规人同种异体输血面临以下几点难以克服的缺点：⑴输血前需要耗时进行交叉配型，存在血型不符引起溶血反应的风险；⑵输血传播相关疾病，如艾滋病(HIV)、乙肝(HBV)、丙肝(HCV)、西尼罗河病毒及疯牛病等。顶尖级科学家们均认为，人工血液是解决这一临床危机的唯一出路。重建人红细胞代用品(Reconstitutionofhumanerythrocytesubstitutes)是具有氧传递功能、维持血液渗透压和酸碱平衡及扩充容量的人工制剂。理想的血液代用品要求具有天然红细胞的氧传递功能、生物相容性、安全性和稳定性。具体为：⑴具有较高的氧传递功能，氧分压在正常生理范围内，能有效向组织供氧；⑵与人血液所有成分具有良好的生物相容性；⑶能维持血液渗透压、酸碱平衡、粘稠度和血容量；⑷无免疫原性(无致敏原性)、无血液病原微生物污染、无热源；⑸体内循环半寿期在24h以上，在正常灌注条件下不产生肾毒性等副作用；⑹在低温条件下，产品保质期大于6个月；⑺具有预期的可清除性。同时，作为一种产品，它的市场生命力还取决于同现行输血用血液相比的更适合的价效比、安全度以及保质期。从20世纪60年代开始，科研工作者就从人工高分子化合物(主要是氟碳化合物)和血红蛋白(Hemoglobin,Hb)两个方向研究具有载氧功能的血液代用品，而我国的血液代用品研究起步于20世纪70年代。目前研制的血液代用品主要集中在两大类：一是基于氟碳化合物的载氧剂(Perfluorocarbons，PFCs)。二是基于血红蛋白的载氧剂(Hemoglobin-basedoxygencarriers，HBOCs)。氟碳化合物是由人工化学合成的直链或环状碳氢化合物的氟取代物，不能直接溶于水，需经过表面活性剂乳化后才可溶于水输入体内，能高效地溶解气体(如氧气、二氧化碳等)。氟碳化合物的氧解离曲线呈直线，溶解氧气的能力较强，可以达到血液的2倍，并且不受pH值变化的影响。目前，基于氟碳化合物的载氧溶液在临床急救手术中使用，由于在血液大量稀释过后依然能够保持较高的组织供氧能力，可以减少用于体外循环的血液用量。而且，利用其能够大量溶解气体的特性，氟碳化合物被应用于心肺分流术中，溶解体外循环过程中引入的小气泡，可以防止形成空气栓塞。但是从严格意义上讲，氟碳化合物并不是真正的血液代用品，其作用只是在血液极稀释情况下维持组织的氧合作用，延缓后续输血的时间。体内循环时间过短也是氟碳化合物类血液代用品存在的问题，限制了它的实用性。另一方面，患者输入氟碳化合物载氧溶液后在临床上会发生一些副作用，比如短暂的流感样综合征，如背痛、发烧、寒战、恶心。人体无法通过正常的代谢途径降解并利用氟碳化合物，输入人体后以异物形式被网状内皮系统吞噬，沉积在肝、脾、骨髓和肺中。然而，网状内皮系统的处理能力终归有限，可能导致未被处理的氟碳化合物在体内永久沉积，这可能也是目前氟碳化合物类血液代用品未被推广使用的主要原因。而基于血红蛋白的载氧剂主要包括无细胞基质血红蛋白和具有类细胞结构的包封血红蛋白。通过化学修饰、化学合成以及基因重组和转基因动物人源化改造等制备的血红蛋白均属于无基质血红蛋白；而脂质体包封血红蛋白、微囊化血红蛋白以及重建人红细胞等则属于包封血红蛋白。多年来，基于血红蛋白的载氧剂研究主要致力于稳定血红蛋白四聚体、延长体内循环时间以及减少其毒副作用等方面，血红蛋白的不同化学修饰、分子交联、聚合、脂质体包封和基因工程改造重组血红蛋白等方法被相继使用。经过半个世纪的研究主要开发出三大类修饰血红蛋白制品：第一类为化学修饰改性血红蛋白，制备技术相对成熟，有多个产品进行过临床试验；第二类为利用基因工程制备的重组血红蛋白；第三类为微囊包封血红蛋白，其结构和功能更接近天然红细胞，是目前红细胞代用品研究比较新的领域，具有发展前景。前期临床研究表明，基于氟碳化合物的载氧剂和基于血红蛋白的载氧剂这两大类血液代用品可用于局部恢复血液携氧功能，防止或恢复低血容量及其引起的器官衰竭等作用，但突出的缺点是氧的释放、代谢产物毒性等问题将严重限制其进一步发展。国内在可降解高分子血红蛋白微囊血液代用品方面的研究起步较晚，而国际上比较有代表性的ChangTMS等报道了采用聚合物包封血红蛋白的路线。包封技术为设计合成更适应于人体需要的红血球模拟物提供了有力的工具。以往包裹材料主要是人工合成的高分子生物可降解脂溶性材料，这类材料因存在毒性和易被吞噬细胞所吞噬等问题影响了其进一步发展。现在，越来越多的研究团队把目光聚焦于红细胞本身，红细胞是血液中的固有成分，和人工材料相比，红细胞的空囊结构、高生物相容性和在血液中循环时间长使得其具有明显的优势。以红细胞膜为药物载体的思路，也给我们的人红细胞体外重建提供了方向。
技术实现思路
本专利技术解决上述技术问题，提供一种体外重建人红细胞代用品及其制备方法，以降低生物免疫排斥反应的人红细胞膜为载体，通过低渗法及细胞膜的流动性加载血红蛋白，进行人红细胞的体外重建。血源为健康人血(A型、B型、AB型、O型血)。本专利技术采用的技术方案是：一种体外重建的人红细胞代用品，由以下方法制备：(1)制备血影细胞载体用等渗磷酸盐缓冲液洗涤全血，将血液分离，去除血浆、白细胞、血小板等，得到红细胞；然后将红细胞置于破膜液中进行处理；之后进行高速冷冻离心，收集上清液，即得溶血液，离心洗涤至上清无色透明，沉淀即为血影细胞载体。(2)制备加载液将步骤(1)中的溶血液用10kD的超滤离心管分离，离心条件为3900rpm，4℃，离心30mins，以得到浓缩血红蛋白液；同时，用25％氯化钠溶液调节溶血液，使得溶血液的氯化钠终浓度分别为0％、0.05％、0.1％、0.2％或0.4％；最后根据需要将经氯化钠溶液调节后的溶血液和浓缩血红蛋白液混匀，配制成血红蛋白液，即为加载液；血红蛋白液的渗透压为20～200mOSM/L，血红蛋白浓度为20～150g/L。(3)体外重建人红细胞将步骤(1)所述血影细胞载体缓慢恢复等渗，将其置于加载液中，混匀，进行孵育，之后进行冷冻离心，弃上清液，再用等渗磷酸盐缓冲液洗涤沉淀至上清透明，沉淀即为重建人红细胞。所述孵育温度为0℃，孵育时间为1～60min，之后于室温放置1～60min，再在37℃孵育1～60min。所述冷冻离心的条件为，1～30min，4℃，200～5000rpm。所述血影细胞载体与加载液的体积比为1:1～20。本专利技术获得的体外重建的人红细胞代用品在制备不同携/释氧能力的血液代用品中的应用。即可以在加载液中添加2,3-DPG(2,3-二磷酸甘油酸)和ATP等物质。本专利技术获得的体外重建的人红细胞代用品在制备抗癌药物或医学影像示踪剂中的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种体外重建的人红细胞代用品，其特征在于，由以下方法制备：(1)制备血影细胞载体用等渗磷酸盐缓冲液洗涤全血，将血液分离，去除血浆、白细胞、血小板等，得到红细胞；然后将红细胞置于破膜液中进行处理；之后进行高速冷冻离心，收集上清液，即得溶血液，离心洗涤至上清无色透明，沉淀即为血影细胞载体；(2)制备加载液将步骤(1)中的溶血液用10kD的超滤离心管分离，离心条件为3900rpm，4℃，离心30mins，以得到浓缩血红蛋白液；同时，用25％氯化钠溶液调节溶血液，使得溶血液的氯化钠终浓度分别为0％、0.05％、0.1％、0.2％或0.4％；最后根据需要将经氯化钠溶液调节后的溶血液和浓缩血红蛋白液混匀，配制成血红蛋白液，即为加载液；(3)体外重建人红细胞将步骤(1)所述血影细胞载体缓慢恢复等渗，将其置于加载液中，混匀，进行孵育，之后进行冷冻离心，弃上清液，再用等渗磷酸盐缓冲液洗涤沉淀至上清透明，沉淀即为重建人红细胞。

【技术特征摘要】
1.一种体外重建的人红细胞代用品，其特征在于，由以下方法制备：(1)制备血影细胞载体用等渗磷酸盐缓冲液洗涤全血，将血液分离，去除血浆、白细胞、血小板等，得到红细胞；然后将红细胞置于破膜液中进行处理；之后进行高速冷冻离心，收集上清液，即得溶血液，离心洗涤至上清无色透明，沉淀即为血影细胞载体；(2)制备加载液将步骤(1)中的溶血液用10kD的超滤离心管分离，离心条件为3900rpm，4℃，离心30mins，以得到浓缩血红蛋白液；同时，用25％氯化钠溶液调节溶血液，使得溶血液的氯化钠终浓度分别为0％、0.05％、0.1％、0.2％或0.4％；最后根据需要将经氯化钠溶液调节后的溶血液和浓缩血红蛋白液混匀，配制成血红蛋白液，即为加载液；(3)体外重建人红细胞将步骤(1)所述血影细胞载体缓慢恢复等渗，将其置于加载液中，混匀，进行孵育，之后进行冷冻离心，弃上清液，再用等渗磷酸盐缓冲液洗涤沉淀至上清透明，沉淀即为重建人红细胞。2.根据权利要求1所述一种体外重建的人红细胞代用品，其特征在于：步骤(2)中所述血红蛋白液的渗透压为20～200mOSM/L，血红蛋白浓度为20～150g/L。3.根据权利要求1所述一种体外重建的人红细胞代用品，其特征在于：步骤(3)所述孵育温度为0℃，孵育时间为1～60min，之后于室温放置1～60min，再在37℃孵育1～60min；所述冷冻离心的条件为，1～30min，4℃，200～5000rpm。4.根据权利要求3所述一种体外重建的人红细胞代用品，其特征在于：步骤(3)所述血影细胞载体与加载液的体积比为1:1～20。5.一种体外重建的人红细胞代用品的制备方法，包括以下步骤：(1)制备血影细胞载体用等渗磷酸盐缓冲液...

【专利技术属性】
技术研发人员：王翔，赵押金，候鳗，陈东，任扬，党琦，李春龚，
申请(专利权)人：重庆大学，
类型：发明
国别省市：重庆,50