环节动物血红蛋白冷冻干燥法制造技术

本发明专利技术涉及包含环节动物的至少一种珠蛋白、一种珠蛋白原聚体或一种细胞外血红蛋白，和选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂的冻干物。本发明专利技术还涉及一种组合物，包含含有环节动物的至少一种珠蛋白、一种珠蛋白原聚体或一种细胞外血红蛋白的溶液，和一种选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂。最后，本发明专利技术涉及制备所述冻干物的方法。

Freeze-drying of link animal hemoglobin

【技术实现步骤摘要】
环节动物血红蛋白冷冻干燥法本申请是申请日为2013年6月5日，申请号为201380041489.0，专利技术名称为“环节动物血红蛋白冷冻干燥法”的专利技术专利申请的分案申请。
本专利技术涉及环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的冷冻干燥方法，以及所获得的冻干物。
技术介绍
环节动物的细胞外血红蛋白作为血液代用品，可能治疗与缺氧相关的问题。术语“血液代用品”的意思是指可以通过提供氧载体来补偿出血后失血的任意产品或溶液。血液代用品不同于人造血，因为血液代用品不能完成血液提供的所有功能，例如激素运输。目前，已知两种药物类的替代品：它们是全氟化碳(PFCs)和血红蛋白氧载体(HBOC)。PFC是允许O2以溶解在血液中的形式运输至组织的化学合成化合物。HBOC来自于牛HB或人HB(后者来自过期的血袋)的纯化后化学修饰，或通过基因工程合成得到。为储存HBOC，传统的方法是在溶液中调节血红蛋白分子。为保证更好的稳定性，在某些情况下，需要在使用前将其储存于-20℃和-80℃之间。然后用干冰运输以确保其不会解冻。这些各种条件涉及额外的成本和更严格的储存和运输物流，证明其对于某些应用是有限制性的。因此，需要一种包括在没有致冷条件的远程环境下容易储存和运输的功能性血红蛋白。一种解决的办法是冷冻干燥法。然而，初步研究表明血红蛋白分子在冷冻干燥过程中部分降解，因此特别地损害其功能性，即其可逆地结合氧的能力。此外，这在蛋白质文献中也有总体描述(HellerMartin.C,CarpenterJohn.F,RandolphTheodore.W,“ProteinFormulationandLyophilizationCycleDesign:PreventionofDamageduetoFreeze-ConcentrationInducedPhaseSeparation”BiotechnologyandBioengineering,Vol63,No.2,1999)。本专利技术人发现了，令人惊讶的是，环节动物的细胞外血红蛋白，当与特定的稳定剂混合时，能被冻干的同时保持其四级结构、其功能性以及其功效。
技术实现思路
因此，本专利技术涉及环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的冷冻干燥方法。本专利技术还涉及所获得的冻干物。事实上后者可以将环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白及其珠蛋白原聚体以经济实用(例如，需要最小的空间)的形式储存，并同时保持该血红蛋白的结构和功能性质。本专利技术的冻干物包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白，和选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂。本专利技术还涉及一种组合物，其包含：-含有环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、珠蛋白原聚体或珠蛋白的溶液，和-选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂，优选地选自海藻糖和抗坏血酸。环节动物的细胞外血红蛋白在三类环节动物中存在：多毛纲、寡毛纲和无毛纲。提及细胞外血红蛋白是因为其不是天然地包含在细胞中，且因此可以在血流中自由循环，而不需化学修饰以使其稳定或使其起作用。环节动物的细胞外血红蛋白是分子量为2000至4000kDa的巨大生物聚合物，其由一般分为两个类别的4至12种不同类型的大约200个多肽链组成。第一类有144至192个组分，组合成为带有血红素类型活性位点且能可逆地结合氧的“功能性”多肽链；这些是珠蛋白类型的链，其重量为15至18kDa，且其与脊椎动物的α-和β-型链非常相似。第二类有36至42个组分，组合成为具有很少或没有活性位点但能够使亚单元组装在一起的“结构性”或“接头”多肽链，所述亚单元称为十二分之一亚单元或原聚体。每个血红蛋白分子由两个叠加的六角形构成，其被称为六角形双层且每个六角形本身由水滴形式的六个亚单元组装形成(或“十二分之一亚单元”或“原聚体”)。该天然分子由十二个这些亚单元(十二具体或原聚体)构成。每个亚单元的分子量在200和250kDa之间，并构成该原始分子的功能性单元。优选地，环节动物的细胞外血红蛋白选自多毛纲环节动物的细胞外血红蛋白，优选沙蠋科(Arenicolidae)的细胞外血红蛋白和沙蚕科(Nereididae)的细胞外血红蛋白。甚至更优选地，所述环节动物的细胞外血红蛋白选自海沙蠋(Arenicolamarina)的细胞外血红蛋白和沙蚕属(Nereis)的细胞外血红蛋白，更优选海沙蠋的细胞外血红蛋白。根据本专利技术，所述冻干物或组合物还可以包含环节动物的细胞外血红蛋白的至少一种珠蛋白原聚体。所述原聚体构成以上所述的原始血红蛋白的功能单元。最后，所述冻干物或组合物还可以包含环节动物的细胞外血红蛋白的至少一种珠蛋白链。这样的珠蛋白链可以特别地选自环节动物细胞外血红蛋白的Ax和/或Bx型珠蛋白链。环节动物的细胞外血红蛋白及其珠蛋白原聚体具有固有的超氧化物歧化酶(SOD)活性，且不需要抗氧化剂来发挥功能，这与使用哺乳动物血红蛋白相反，对于哺乳动物血红蛋白抗氧化剂分子含于红血球中且不结合到血红蛋白上。此外，环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白原聚体和/或其珠蛋白不需要辅助因子以发挥功能，这与哺乳动物血红蛋白(尤其是人血红蛋白)相反。最后，环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白原聚体和/或其珠蛋白不具有血型；这使得可以避免免疫反应的任何问题。环节动物的细胞外血红蛋白、其珠蛋白原聚体和/或其珠蛋白可以是天然的或重组的。本专利技术的组合物还包含一种溶液。该溶液能够产生适合所述血红蛋白、其原聚体和其珠蛋白的盐水环境，因而可以维持这些分子的四级结构及其功能性。利用该溶液，所述血红蛋白、其原聚体和其珠蛋白能够发挥其氧合功能。本专利技术的溶液是一种含盐的水溶液，优选氯、钠、钙、镁和钾离子，使得本专利技术组合物的pH为6.5至7.8；其配方与生理可注射液体的相似。在这些条件下，环节动物的所述细胞外血红蛋白、其珠蛋白原聚体和其珠蛋白仍然能起作用。在本说明书中，除非另有说明，pH是指在环境温度(20±5℃)下。优选地，所述溶液是包含氯化钠、氯化钙、氯化镁、氯化钾，以及含包含葡萄糖酸钠和醋酸钠，且pH为6.5-7.8，优选等于7.1±0.5，优选大约7.35的水溶液。更优选地，稳定溶液是包含0-100mMNaCl，优选90mMNaCl、23mM葡萄糖酸钠、2.5mMofCaCl2、27mM醋酸钠、1.5mMMgCl2、5mMKCl，且pH为7.1±0.5，可能含有0至100mM的抗坏血酸和/或还原型谷胱甘肽型抗氧化剂的水溶液。所述溶液优选摩尔渗透压浓度为300-450，优选300-350，和优选302mOsmol/l。本专利技术的组合物和冻干物还包含稳定剂。所述稳定剂维持了血红蛋白、其珠蛋白和其原聚体的四级结构以及其功能性，即使是在冷冻干燥之后。术语“稳定剂”的意思是指一种双糖、一种多元醇和/或一种抗氧化剂。所述双糖特别包含蔗糖、海藻糖和棉子糖，优选海藻糖。稳定剂的效力通过比较冷冻干燥前后血红蛋白的理化和功能性质来确定。本专利技术的稳定剂选自双糖、多元醇和/或抗氧化剂。优选地，所述双糖选自海藻糖和蔗糖。更优选地，所述双糖是海藻糖。优选地，所述多元醇选自甘露醇和山梨醇。最后优选地，所述抗氧化剂是抗坏血酸。海藻糖也称为α-D-吡喃葡糖基-α-D-吡喃葡糖苷或α,α-海藻糖，或α-D-吡本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、一种珠蛋白原体或一种珠蛋白，和一种选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂的冻干物。

【技术特征摘要】
2012.06.05 FR 12552041.包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、一种珠蛋白原体或一种珠蛋白，和一种选自双糖、多元醇和抗氧化剂的稳定剂的冻干物。2.组合物，包含：-含有环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、一种珠蛋白原聚体或一种珠蛋白的溶液，和-一种选自海藻糖和抗坏血酸的稳定剂。3.如权利要求1所述的冻干物或如权利要求2所述的组合物，其中所述环节动物的细胞外血红蛋白选自多毛纲环节动物的血红蛋白，优选选自沙蠋科(Arenicolidae)的细胞外血红蛋白和沙蚕科(Nereididae)的细胞外血红蛋白，更优选选自海沙蠋(Arenicolamarina)的细胞外血红蛋白和沙蚕(Nereis)的细胞外血红蛋白。4.如权利要求1或3所述的冻干物，其中所述稳定剂选自海藻糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇和抗坏血酸，优选选自海藻糖和抗坏血酸。5.制备如权利要求1、3或4中任一项所述的冻干物的方法，包括：i)将包含环节动物的至少一种细胞外血红蛋白、一种珠蛋白原聚体或一种珠蛋白的溶液与选自双糖、多元醇和抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：F·察尔，M·鲁斯洛，
申请(专利权)人：埃玛里纳，
类型：发明
国别省市：法国,FR