一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法，包括干燥叶片研磨、去糖、裂解、抽提、沉淀、洗涤和检测等步骤。其中，去糖是本发明专利技术的关键，在核膜没有裂解释放出基因组DNA之前，加入预热的去糖缓冲液，在65℃水浴条件下悬浮叶片组织溶液，可以使多糖及其他次生代谢物质溶解于缓冲液中，再通过低速离心去除多糖等杂质，使最后沉淀得到DNA的具有较高的浓度和纯度。采用本发明专利技术所述的提取方法流程能有效去除叶片组织中的多糖，所得到DNA的纯度高，完整性和流动性好，可迅速溶解于水或者TE，溶解后不会析出沉淀，溶液不粘稠，0.6％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小集中于40K～60K之间。

A Method for DNA Extraction from Dry Leaves of Polysaccharide Plants

The invention discloses a method for extracting DNA from dried leaves of polysaccharide plants, which includes grinding, sugar removal, lysis, extraction, precipitation, washing and detection of dried leaves. Among them, sugar removal is the key of the present invention. Before the release of genomic DNA from the nuclear membrane without cleavage interpretation, the preheated sugar removal buffer is added to suspend the leaf tissue solution under the condition of water bath at 65 C, which can dissolve polysaccharides and other secondary metabolites in the buffer solution, and then remove impurities such as polysaccharides by low-speed centrifugation, so that the final precipitation of DNA has a high concentration and purity. The extraction process of the invention can effectively remove polysaccharide from the leaf tissue, and the obtained DNA has high purity, integrity and fluidity, can be quickly dissolved in water or TE, does not precipitate after dissolution, the solution is not sticky, and 0.6% agarose gel electrophoresis detection size is concentrated between 40K and 60K.

【技术实现步骤摘要】
一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法。
技术介绍
获得高质量DNA的是分子生物学实验最关键的第一步，目前，已经发展了多种方法，成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是植物材料由于大都含有种类繁多的次生代谢物质，有些情况下，不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物，获得DNA的溶液常常黏度大乃至呈胶状，是植物DNA提取中最常见现象，主要原因是多糖、酚类在提取过程中与DNA共沉淀，形成包裹DNA的黏稠胶状物，难以溶解或产生褐变，获得DNA的常出现产量低、质量差、易降解，严重影响了DNA质量和纯度，不能被限制性内切酶酶切，严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。所以，如何高效简便地去除多糖、多酚等次生代谢物质，对提取纯化植物DNA来说至关重要。樱属植物为典型的多年生木本果树作物，其成熟叶片中富含大量酚类物质和多糖，尤其多糖含量极为丰富，所得DNA粗提液为粘稠胶状物，流动性极差，严重限制后续分子实验的进行。目前传统方法一般都是采取春季幼嫩未完全展开的叶片进行提取且多采用新鲜或冷冻的材料，其相对于干燥成熟叶片所含的此生代谢物质较少，所得DNA勉强可以供后续对DNA质量要求不高的实验使用。但由于受时间和实验进度的影响，再加上春季取样时间极短及取样地距离的影响，获得幼嫩叶片难度较大，通常需在夏季取硅胶干燥的成熟叶片。对于干燥的成熟叶片采用传统的提取方法很难的到理想DNA的。因此，针对樱属及其它植物干燥成熟叶片富含多糖、多酚及其它次生代谢产物的特点，高效简便地去除多糖、多酚等次生物质，对提取纯化植物DNA来说至关重要，同时为夏秋季无法获得幼叶等其它幼嫩材料时从事果树基因组研究提供新的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法，以有效克服上述现有技术的不足。本专利技术解决技术问题的方案是：一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法，包括以下步骤：1)取变色硅胶干燥的叶片0.5～1.0g，加PVP与VC的研钵中加液氮研磨成粉；2)将研磨好的叶片粉末转入2.0ml离心管中，每管0.2～0.4g，加入1.5ml65℃预热的去糖缓冲液和10μlβ-巯基乙醇，充分混合后在65℃水浴10min；3)在常温下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀；4)在沉淀中加入1ml65℃预热的3％的CTAB和10μlβ-巯基乙醇，65℃水浴40min或1h时，期间每隔5～10min颠倒离心管以使液体混匀，然后常温下12500rpm离心10min；5)取上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的氯仿，轻摇萃取5min，直到氯仿相溶液变色，在8℃下12500rpm离心10min；6)上清液转入新的2.0ml离心管中，重复步骤5)；7)取上清液约600μl转入新的1.5ml离心管中，加入2倍体积经-20℃预冷的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀-20放置30min，10000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀；8)在DNA沉淀中加入75％乙醇800μl，轻摇并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗两次，再用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干；9)DNA沉淀用50μlTE溶解，置于-20℃冰箱保存备用；10)取2μl溶解DNA的溶液，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度。所述步骤1)中所述的去糖缓冲液为1mol/L氯化钠；0.1mol/LTris-HClPH8.0；0.02mol/LEDTAPH8.0；0.4mol/L葡萄糖。所述步骤4)中所述的CTAB为1.5mol/lNaCl；0.1mol/LTris-HclPH8.0；0.02mol/LEDTAPH8.0；2％PVP。所述多糖类植物为樱属植物。与现有技术相比，本专利技术具有的优点是：本专利技术采用多糖含量很多的樱属植物干燥成熟叶片为材料提取DNA，采用本专利技术所述的提取方法流程能有效去除叶片组织中的多糖，所得到DNA的纯度高，完整性和流动性好，可迅速溶解于水或者TE，溶解后不会析出沉淀，溶液不粘稠，0.6％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小集中于40K～60K之间。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的详细说明：实施例：一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法，包括以下步骤：1)取变色硅胶干燥的叶片0.5g，加PVP与VC的研钵中加液氮研磨成粉；2)将研磨好的叶片粉末转入2.0ml离心管中，每管0.2g，加入1.5ml65℃预热的去糖缓冲液和10μlβ-巯基乙醇，充分混合后在65℃水浴10min；3)在常温下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀；4)在沉淀中加入1ml65℃预热的3％的CTAB和10μlβ-巯基乙醇，65℃水浴40min或1h时，期间每隔5～10min颠倒离心管以使液体混匀，然后常温下12500rpm离心10min；5)取上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的氯仿，轻摇萃取5min，直到氯仿相溶液变色，在8℃下12500rpm离心10min；6)上清液转入新的2.0ml离心管中，重复步骤5)；7)取上清液约600μl转入新的1.5ml离心管中，加入2倍体积经-20℃预冷的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀-20放置30min，10000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀；8)在DNA沉淀中加入75％乙醇800μl，轻摇并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗两次，再用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干；9)DNA沉淀用50μlTE溶解，置于-20℃冰箱保存备用；10)取2μl溶解DNA的溶液，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度。所述步骤1)中所述的去糖缓冲液为1mol/L氯化钠；0.1mol/LTris-HClPH8.0；0.02mol/LEDTAPH8.0；0.4mol/L葡萄糖。所述步骤4)中所述的CTAB为1.5mol/lNaCl；0.1mol/LTris-HclPH8.0；0.02mol/LEDTAPH8.0；2％PVP。所述多糖类植物为樱属植物。本专利技术采用多糖含量很多的樱属植物干燥成熟叶片为材料提取DNA，采用本专利技术所述的提取方法流程能有效去除叶片组织中的多糖，所得到DNA的纯度高，完整性和流动性好，可迅速溶解于水或者TE，溶解后不会析出沉淀，溶液不粘稠，0.6％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小集中于40K～60K之间。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：1)取变色硅胶干燥的叶片0.5～1.0g，加PVP与VC的研钵中加液氮研磨成粉；2)将研磨好的叶片粉末转入2.0ml离心管中，每管0.2～0.4g，加入1.5ml65℃预热的去 糖缓冲液和10μlβ‑巯基乙醇，充分混合后在65℃水浴10min；3)在常温下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀；4)在沉淀中加入1ml65℃预热的3％的CTAB和10μlβ‑巯基乙醇，65℃水浴40min或1h时，期间每隔5～10min颠倒离心管以使液体混匀，然后常温下12500rpm离心10min；5)取上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的氯仿，轻摇萃取5min，直到氯仿相溶液变色，在8℃下12500rpm离心10min；6)上清液转入新的2.0ml离心管中，重复步骤5)；7)取上清液约600μl转入新的1.5ml离心管中，加入2倍体积经‑20℃预冷的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀‑20放置30min，10000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀；8)在DNA沉淀中加入75％乙醇800μl，轻摇并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗两次，再用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干；9)DNA沉淀用50μl TE溶解，置于‑20℃冰箱保存备用；10)取2μl溶解DNA的溶液，经1％琼脂糖凝胶电泳检测，并在Eppendorf Biophotomete型核酸蛋白质分析仪上检测260nm、280nm处的吸收值和DNA的浓度，并根据OD260/OD280值来判断DNA的纯度。...

【技术特征摘要】
1.一种适用于多糖类植物干燥叶片DNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：1)取变色硅胶干燥的叶片0.5～1.0g，加PVP与VC的研钵中加液氮研磨成粉；2)将研磨好的叶片粉末转入2.0ml离心管中，每管0.2～0.4g，加入1.5ml65℃预热的去糖缓冲液和10μlβ-巯基乙醇，充分混合后在65℃水浴10min；3)在常温下5000rpm离心3min，弃上清，收集沉淀；4)在沉淀中加入1ml65℃预热的3％的CTAB和10μlβ-巯基乙醇，65℃水浴40min或1h时，期间每隔5～10min颠倒离心管以使液体混匀，然后常温下12500rpm离心10min；5)取上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的氯仿，轻摇萃取5min，直到氯仿相溶液变色，在8℃下12500rpm离心10min；6)上清液转入新的2.0ml离心管中，重复步骤5)；7)取上清液约600μl转入新的1.5ml离心管中，加入2倍体积经-20℃预冷的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀-20放置30min，10000rpm离心15min，弃上清，收集沉淀；8)在DNA沉淀中加入...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴娟，
申请(专利权)人：成都世纪非红科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51