mRNA及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及mRNA分子技术领域，具体提供一种mRNA及其制备方法和应用。该mRNA的制备方法包括以下步骤：提供DNA转录模板；所述DNA转录模板由正义链和反义链组成，其中，正义链包含启动子以及连接在所述启动子序列上的目标DNA序列，启动子序列不含有终止密码子，目标DNA序列与目标mRNA序列相同，所述目标DNA序列末端连接有聚多腺苷酸序列；在RNA聚合酶的作用下，对所述DNA转录模板进行体外转录，在所述启动子序列的引导下，转录出mRNA。本发明专利技术的制备方法解决了现有mRNA合成进行Poly A加尾反应时副产物序列增多而导致分子均一性差的问题，且该制备方法还具有制备效率高、产物便于纯化等优势。

【技术实现步骤摘要】
mRNA及其制备方法和应用
本专利技术属于mRNA分子
，具体涉及一种mRNA及其制备方法和应用。
技术介绍
随着核酸技术的发展，基因治疗越来越成为医药行业的热点。作为一种重要的基因疗法，mRNA药物越来越受到市场的青睐。mRNA分子被递送到细胞内可产生各种蛋白，包括可溶性蛋白、膜蛋白和细胞内蛋白，尤其是可以产生传统制药方法五和获得的蛋白。与DNA基因治疗相比，mRNA是一种瞬时表达的工具，具有更好的生物安全性和成药性。随着分子生物学、基因工程、生物化学的发展和完善，人们可以在体外合成大量的mRNA药物分子，这为基于mRNA的基因疗法带来了巨大的机遇。目前常见的mRNA的合成方法为体外逆转录法，具体合成路线详见图1所示，即用T7、T3或SP6RNA聚合酶转录带有其启动子的双链DNA模板获得长单链mRNA分子，通过优化转录反应体系中的Mg2+、三磷酸核苷酸(rNTP)的浓度，一个拷贝DNA模板能产生几十到数百个拷贝的mRNA分子，因此，该方法最大的有限是可以规模化合成大量的mRNA产物，同时可以对mRNA产物进行同位素标记或者荧光染料标记，并且转录长度不受限制等。但是同时这套合成方法也存在技术限制和缺点，其一就是价格昂贵，合成mRNA长度超过100nt时，其合成效率会大幅度降低，其二是现有合成技术水平合成的mRNA药物分子均一性不高，特别是在mRNA产物3’端进行PolyA加尾反应时，由于不可控造成副产物序列增多，增加了纯化的难度，并会进一步导致高成本。此外，随着科研和市场的发展，以往的合成方法已经逐渐不能满足科研试验和药物研发对mRNA的需求，越来越多的mRNA生物研究和药物研发中需要用到毫克级甚至克级的mRNA，与此同时对RNA产品的质量、纯度也提出了更高的要求。
技术实现思路
针对现有mRNA药物分子合成方法合成效率低、副产物序列多、合成的分子均一性差、难以纯化等问题，本专利技术提供一种mRNA的制备方法。进一步地，本专利技术还提供上述mRNA的制备方法获得的mRNA及其用途。为达到上述专利技术目的，本专利技术采用了如下的技术方案：一种mRNA的制备方法，包括以下步骤：步骤S01.提供DNA转录模板；所述DNA转录模板由正义链和反义链组成，其中，所述正义链包含启动子以及连接在所述启动子序列上的目标DNA序列，所述启动子序列不含有终止密码子，所述目标DNA序列与目标mRNA序列相同，所述目标DNA序列末端连接有聚多腺苷酸序列；步骤S02.在RNA聚合酶的作用下，对所述DNA转录模板进行体外转录，在所述启动子序列的引导下，转录出mRNA。相应地，一种mRNA，所述mRNA采用如上所述的制备方法制备得到。以及，一种生物药物，所述生物药物中含有mRNA，所述mRNA为如上所述的mRNA。本专利技术的有益效果在于：相对于现有技术，本专利技术提供的mRNA的制备方法，创造性地构建了mRNA转录模板，先将腺嘌呤直接连在DNA转录模板正义链的末端，提高转录稳定性，解决了现有mRNA合成后再于3’端进行Poly-A序列加尾反应时副产物序列增多而出现分子均一性差的问题，并且该制备方法还具有制备效率高、产物便于纯化等优势，可以极大的提高生产效率，降低生产成本。此外，采用本制备方法，可以合成具有高纯度的任意基因的mRNA。本专利技术提供的mRNA，由于其是采用上述方法制备得到，因而其具有分子均一性好等特点，因此其质量、纯度相对于常规的mRNA而言更高，能够极大的满足mRNA生物研究和药物研发中对mRNA毫克级甚至克级别的需求。通过本专利技术的制备方法获得的mRNA，分子均一性好，稳定性强，纯度高，具有良好的成药性和疗效。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为现有mRNA的合成方法的合成线路示意图；图2为本专利技术提供的mRNA的制备方法的制备线路示意图；图3为本专利技术实施例1和对比例1制备的mRNA的分子均一性检测图谱；图4为本专利技术对比例1制备的mRNA(绿色荧光蛋白GFPmRNA)转染293T细胞12h后的镜检图；图5为本专利技术实施例1制备的mRNA(绿色荧光蛋白GFPmRNA)转染293T细胞12h后的镜检图；图6为本专利技术实施例1和对比例1制备的mRNA在皮肤组织修复的药物活性对比图；其中，图示中plasmidDNA表示质粒DNA；5’UTR表示5’端非转录区域；3’UTR表示3’端非转录区域；Genesequence表示基因序列；Codingsequence(CDS)表示编码序列；Cap表示mRNA帽子状结构；Start表示启动子；Stop表示终止密码子；Poly-Atail表示多聚腺苷酸尾；Poly-Asequence表示多聚腺苷酸序列。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术提供一种mRNA的制备方法。该mRNA的制备方法包括以下步骤：步骤S01.提供DNA转录模板；所述DNA转录模板由正义链和反义链组成，其中，所述正义链包含启动子序列以及连接在所述启动子序列上的目标DNA序列，所述启动子序列不含有终止密码子，所述目标DNA序列与目标mRNA序列相同，所述目标DNA序列末端连接有聚多腺苷酸序列；步骤S02.在RNA聚合酶的作用下，对所述DNA转录模板进行体外转录，在所述启动子序列的引导下，转录出mRNA。下面对本专利技术的技术方案做详细的解释说明：步骤S01中，DNA转录模板中，正义链上的启动子序列选自T3启动子序列、T7启动子序列、SP6启动子序列中的任一种。在体外转录中，这几类启动子的转录效率最高。上述目标DNA序列末端连接的聚多腺苷酸序列(Poly-Asequence)长度为100bp～300bp。如果长度过长，会影响mRNA分子的翻译效果，长度过短，则会影响mRNA分子的稳定性。优选地，上述DNA转录模板可以采用如下方式两种方式之一进行制备：(1)合成所述DNA转录模板的两条引物，PCR扩增得到DNA转录模板。(2)采用限制性内切酶线性化质粒DNA模板获得所述DNA转录模板。上述方式(1)涉及的两条引物为：Forwardprimer：5’-TAATACGACTCACTATAGG-3’；Reserveprimer：5’-CTTCCTACTCAGGCTTTATTCAAAGACCA-3’。PCR扩增的条件为：按下列组份配制PCR反应液Pfu(5U/μL)0.5μL；10×PfuPCRBuffer(Mg2+Plus)5μL；dNTPMixture(10mMeach)1μL；模板DNA(质粒5-20ng，基因组100-500ng)XμL；引物1(Forwardprimer)：(20μM)1μL；引物2(Reserveprimer)：(20μM)1μL；灭菌蒸馏水upto50μL。上述方式(2)中，限制性内切酶没有特别的要求，只要在Poly-A序列下游的限制性内切酶均可以使用。所述质粒DNA模板改本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种mRNA的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：步骤S01.提供DNA转录模板；所述DNA转录模板由正义链和反义链组成，其中，所述正义链包含启动子序列以及连接在所述启动子序列上的目标DNA序列，所述启动子序列不含有终止密码子，所述目标DNA序列与目标mRNA序列相同，所述目标DNA序列末端连接有聚多腺苷酸序列；步骤S02.在RNA聚合酶的作用下，对所述DNA转录模板进行体外转录，在所述启动子序列的引导下，转录出mRNA。

【技术特征摘要】
1.一种mRNA的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：步骤S01.提供DNA转录模板；所述DNA转录模板由正义链和反义链组成，其中，所述正义链包含启动子序列以及连接在所述启动子序列上的目标DNA序列，所述启动子序列不含有终止密码子，所述目标DNA序列与目标mRNA序列相同，所述目标DNA序列末端连接有聚多腺苷酸序列；步骤S02.在RNA聚合酶的作用下，对所述DNA转录模板进行体外转录，在所述启动子序列的引导下，转录出mRNA。2.如权利要求1所述的mRNA的制备方法，其特征在于，所述聚多腺苷酸序列的长度为100bp～300bp。3.如权利要求1所述的mRNA的制备方法，其特征在于，所述启动子序列为T3启动子序列、T7启动子序列、SP6启动子序列中的任一种。4.如权利要求1所述的mRNA的制备方法，其特征在于，所述体外转录以三磷酸核苷混合物及其化学修饰物为原料...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，杨雨亭，
申请(专利权)人：深圳市臻质医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44