一种钙通道抑制剂氧海罂粟碱在骨关节炎中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及一种钙通道抑制剂氧海罂粟碱在骨关节炎中的应用。本发明专利技术首次发现了氧海罂粟碱是一种新型的钙通道TRPV5抑制剂，并通过细胞实验证实了氧海罂粟碱能够显著抑制TRPV5及其下游的关键指标的表达，并进一步通过动物实验证实了氧海罂粟碱能显著抑制骨关节炎软骨细胞凋亡和炎症介质的表达。因此，氧海罂粟碱可用于制备治疗骨关节炎的药物，本发明专利技术为治疗骨关节炎提供了一条新的科研思路与临床可行性，对发挥氧海罂粟在骨关节炎的治疗作用上具有重大意义，其具有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种钙通道抑制剂氧海罂粟碱在骨关节炎中的应用
本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种钙通道抑制剂氧海罂粟碱在骨关节炎中的应用。
技术介绍
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨的变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。该疾病在中老年人多发，临床上以关节肿痛、骨质增生及活动受限最为常见。年龄、肥胖、炎症、创伤及遗传因素与本病的发生有关。最常见的症状是：关节疼痛和僵硬，久坐后起立活动时症状明显，活动后稍缓解，但活动过量后又会再加重。骨关节炎主要危险因素：包括肥胖、关节软骨损伤、膝关节畸形、长时间寒冷阴湿环境等。年龄越大患病可能性越大，女性患病风险是男性的2～3倍，多累及手指关节，膝关节、髋关节、脊柱等，是影响老年人活动的最常见关节疾病。采取健康生活方式：积极治疗，有助于身体康复、改善生活质量。OA是影响世界10％-20％人口的最常见的关节疾病。随着现在人口老龄化的日益严重，OA的发病率将进一步飙升。目前，OA多用非甾体类抗炎药实施镇痛抗炎等对症治疗，但是这种治疗不能从根本上解决问题，长期服用还可能给消化系统等带来一些严重的副作用，另外给患者和社会带来了沉重的经济负担。透明质酸(HA)也被广泛的应用于OA的治疗，但是目前研究发现HA对OA的临床症状没有明显的改善。随着近年对OA研究的深入，目前研究证实钙内流的刺激和自噬的抑制在骨关节炎(OA)的发病机制中起重要作用。氧海罂粟碱分子式为C20H17NO5，分子量为351.35268g/mol，结构式如下所示：氧海罂粟碱是一种典型的氧化阿朴啡碱，广泛存在于木兰科、番荔枝科、罂粟科、防己科等中药植物中。氧化阿朴啡类生物碱是一类具有显著药理活性的系列生物碱。以前的研究表明，氧化海罂粟碱具有显著的抗肿瘤、抗病毒，以及抗血小板凝聚、加速组织舒张以及免疫抑制活性等。由于目前对该生物碱生物学功能认识不够深入，一直限制了其在生物领域的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于针对现有技术中的不足，而提供氧海罂粟碱在钙通道抑制剂中的应用。本专利技术的另一目的在于提供氧海罂粟碱在制备治疗骨关节炎药物中的应用。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：本专利技术提供氧海罂粟碱在钙通道抑制剂中的应用。优选的，所述钙通道抑制剂为电压门控钙通道TRPV5抑制剂。本专利技术还提供氧海罂粟碱在制备治疗骨关节炎药物中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术首次发现了氧海罂粟碱是一种新型的钙通道TRPV5抑制剂，并通过细胞实验证实了氧海罂粟碱能够显著抑制TRPV5及其下游的关键指标的表达，并进一步通过动物实验，证实了氧海罂粟碱能显著抑制骨关节炎(OA)软骨细胞凋亡和炎症介质的表达，通过氧海罂粟碱治疗的大鼠关节软骨面更加光滑，显著减少了关节软骨纤维增生，其软骨层的厚度相对于模型组(OA+PBS)大幅增加，更重要的是，从大体观和关节的组织学评分来看，氧海罂粟碱对关节的保护作用甚至比临床的常用药透明质酸还要好。因此，氧海罂粟碱可用于制备治疗骨关节炎的药物，本专利技术为治疗骨关节炎提供了一条新的科研思路与临床可行性，对发挥氧海罂粟在骨关节炎的治疗作用上具有重大意义，其具有广阔的应用前景。附图说明图1为实施例1的氧海罂粟碱对钙通道TRPV5抑制作用的效果图。图2为实施例2的氧海罂粟碱具有显著激活自噬的能力的效果图。图3为实施例3的氧海罂粟碱能显著抑制OA软骨细胞凋亡和炎症介质表达的效果图。图4为实施例4的自噬抑制剂3-MA能够逆转氧海罂粟碱对OA软骨细胞的治疗作用的效果图。图5为实施例5的氧海罂粟碱对OA的治疗作用的效果图。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1.氧海罂粟碱是一种优异的电压门控钙通道TRPV5抑制剂。一、实验方法：1、提取骨关节炎患者的软骨细胞：无菌条件下，收集行关节置换的骨关节炎患者的软骨组织，把软骨组织剪碎成1mm^3见方(即1立方毫米)的组织块；用含青霉素和链霉素混合液冲洗软骨3次。加入软骨体积10-15倍的0.25％胰蛋白酶，37℃消化半小时后终止消化。然后0.02％的二型胶原酶酶消化3小时。液体充分吹打混合、离心1000r/分钟5分钟，去上清液，重悬后将上清液移至10CM的培养皿中，加入10毫升完全培养基，置于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养，24小时可见细胞贴壁，此时首次换液，然后每3天换液1次。约7天细胞长满瓶底，此时进行传代培养，传代用0.25％胰蛋白酶消化5分钟，胎牛血清终止消化，按此法反复传代培养增殖。同样的方法提取SD大鼠的软骨细胞2、细胞活力检测和半量抑制浓度：细胞活力检测：将三代的OA患者的软骨细胞以5000个/孔数量接种在96孔板中，24小时后分别加入浓度为0,1.25ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml,80ng/ml和160ng/ml的氧海罂粟碱溶液。培养24小时后，加入20μLCCK-8试剂盒37℃孵育3小时后用荧光酶标仪检测OD值。半量抑制浓度：将三代的SD大鼠的软骨细胞以5000个/孔的数量接种在96孔板中，24小时后分别加入浓度为0,1.25ng/ml，2.5ng/ml，5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，40ng/ml,80ng/ml和160ng/ml的氧海罂粟碱溶液。培养24小时后，加入20μLCCK-8试剂盒37℃孵育3小时后用荧光酶标仪检测OD值。3、Westernblotting检测：将三代的OA患者的软骨细胞以50000个/孔的数量接种于6孔板中，培养24小时后加入氧海罂粟碱(浓度由细胞活力检测和半量抑制浓度检测实验确定)干预24小时后使用细胞蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白，测定蛋白液的浓度，使用上样量为50ug样品进行电泳和转模，使用封闭液封闭以后，模块被用以孵育一抗(TRPV5,Calmodulin,CAMK-II,LC3-2/1)24小时，孵育荧光二抗两小时后，ODYSSEY双色红外激光成像系统扫膜。4、钙通道荧光检测：将三代的OA患者的软骨细胞以50000个/孔的数量接种于6孔板中，培养24小时后加入氧海罂粟碱(浓度由细胞活力检测和半量抑制浓度检测实验确定)干预24小时后，Fluo-4AM(钙通道荧光探针)工作液加入细胞，在37℃培养20分钟。用PBS清洗三次，荧光显微镜下激发波长494nm下拍摄荧光图片。二、实验结果：结果见图1：如图1a和1b所示，40ng/mL是氧海罂粟碱作用于OA患者的软骨细胞的最适浓度，10,20,和40ng/mL被用于进一步实验；图1c显示氧海罂粟碱能够显著抑制TRPV5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.氧海罂粟碱在钙通道抑制剂中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.氧海罂粟碱在钙通道抑制剂中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述钙通...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟刚，于寅，张耶明，
申请(专利权)人：深圳市臻质医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44