一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，通过先对动物胶质瘤肿瘤细胞的冻存细胞进行单克隆培养，然后选用CRISPR‑Cas9基因技术，针对于MDR1设计各自的sgRNA，并将其插入至腺病毒中并在转染细胞中连续PCR扩增，获得大量病毒液，最后将腺病毒价值胶质瘤肿瘤细胞中，敲除对应的基因片段，从而避免了因这些基因片段损伤突变而使胶质瘤细胞产生耐药性，这种方法基因消除效率高，有助于研究胶质瘤肿瘤耐药的机理，研发更有效的抗肿瘤靶向药。

【技术实现步骤摘要】
一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法
本专利技术属于基因
，特别是一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法。
技术介绍
CRISPR是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。目前，CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，腺病毒载体法是基因治疗中最有前途的基因转移方法之一。载体容易构建和操作，宿主范围广，感染性强，腺病毒载体能有效地将外源基因转移到各种靶细胞或组织中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、取动物胶质瘤肿瘤细胞冻存细胞进行单克隆培养，得胶质瘤肿瘤细胞悬液，备用；A2、针对MDR1中的蛋白质编码序列，通过CRISPR在线设计工具分别设计针对于MDR1的sgRNA；所述MDR1的基因序列如SEQ ID NO.1所示；A3、将各sgRNA插入到腺病毒载体中，使其能表达，得重组腺病毒载体；A4、将重组腺病毒载体转染至转染细胞中，直至出现明显细胞病变后，收集细胞，冻融释放病毒，在转染细胞中连续PCR扩增，获得大量病毒液，分层纯化病毒液，得高浓重组腺病毒载体；A5、将高浓重组腺病毒载体加至胶...

【技术特征摘要】
1.一种利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、取动物胶质瘤肿瘤细胞冻存细胞进行单克隆培养，得胶质瘤肿瘤细胞悬液，备用；A2、针对MDR1中的蛋白质编码序列，通过CRISPR在线设计工具分别设计针对于MDR1的sgRNA；所述MDR1的基因序列如SEQIDNO.1所示；A3、将各sgRNA插入到腺病毒载体中，使其能表达，得重组腺病毒载体；A4、将重组腺病毒载体转染至转染细胞中，直至出现明显细胞病变后，收集细胞，冻融释放病毒，在转染细胞中连续PCR扩增，获得大量病毒液，分层纯化病毒液，得高浓重组腺病毒载体；A5、将高浓重组腺病毒载体加至胶质瘤肿瘤细胞悬液中，敲除胶质瘤肿瘤细胞的MDR1基因，得动物肿瘤模型。2.根据权利要求1所述的利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建动物肿瘤模型的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：靖超，
申请(专利权)人：武汉纤然生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42