一种高效重组痘苗病毒载体及其建立方法技术

本发明专利技术建立了一种高效重组痘苗病毒载体的系统，包括高效重组痘苗病毒载体及其建立方法。本发明专利技术利用CRISPR‑Cas9技术敲除痘苗病毒天坛株TK区，然后转染带有EGFP的重组质粒pJ2R‑EGFP。通过荧光筛选，获得缺失TK并插入EGFP的重组病毒，建立一种高效重组痘苗病毒载体的系统。通过分子克隆技术、Western Blot实验、免疫荧光、病毒噬斑形成试验，发现在第一轮重组病毒筛选过程中重组率比传统同源重组方法有所提高。进一步利用PCR技术、琼脂糖凝胶电泳、测序验证得到的重组病毒准确在特定位点被改造。本发明专利技术将痘苗病毒载体的重组率提高，为其在疫苗载体构建、肿瘤免疫治疗等方面提供应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种高效重组痘苗病毒载体及其建立方法
本专利技术涉及基因重组
，尤其涉及一种高效重组痘苗病毒载体及其建立方法。
技术介绍
痘病毒(Poxvirus)是病毒粒最大的一类DNA病毒，包括多种类型：痘苗病毒(Vacciniavirus)、天花病毒(Variolavirus)、牛痘病毒(Cowpoxvirus)和猴痘病毒(Monkeypoxvirus)等。其中痘苗病毒天坛株(VacciniavirusTiantanstrain，VTT)在消灭天花的过程中发挥重大作用。痘苗病毒具有宿主范围广、非必需基因多、高度保守性、外源基因的容量大、胞质复制等特点。目前，肿瘤的治疗还是一个世界性难题，主要的方法有放化疗、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy，CAR-T)以及单克隆抗体疗法。而溶瘤病毒作为肿瘤治疗新的研究方向，目前已经取得了一些研究成果。以腺病毒(Adenovirus)为载体的溶瘤病毒在转移性非小细胞肺癌和三阴乳腺癌(MetastaticNSCLCTNBCJX-594)及脑癌(Braincancer)中已经进入了临床II期阶段。同时以HSV为载体的Talimogenelaherparepvec(T-VEC)治疗黑色素瘤的研究已进入III期阶段。而在痘病毒中，JX-594作为第一个进入临床阶段用于肿瘤治疗的重组病毒，是在痘苗病毒株WesternReserve的基础上将TK区进行敲除，然后插入粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophageColonyStimulatingFactor,GM-CSF)，在肝癌(Hepatocellelarcarcinoma)治疗中已经进入临床III期，可以和Sorafenib等多种化学治疗药物联合使用抵抗肝癌。另一株重组病毒GL-ONC1(GLV-1h68)是以痘苗病毒Lister株为载体，缺失TK、F4L14.5L、A56R，插入Renillaluciferase-GFP、LacZ、gusA基因，在腹膜癌(peritonealcarcinomatosis)治疗中进入临床II期。痘苗病毒天坛株VTT在我国拥有自主知识产权，以VTT作为载体，建立高效获得重组病毒的系统在肿瘤治疗中具有较大应用价值。同源重组是实现病毒基因组编辑的传统方法，但是其步骤繁琐、过程复杂、周期较长、效率极低，外源插入基因不稳定且不能进行多个病毒蛋白的敲除，阻碍了痘苗病毒载体的发展。因此，获得痘苗病毒的高效重组系统对疫苗载体和溶瘤病毒的研究与开发中起到关键作用。2013年，出现了一项全新的基因编辑技术CRISPR-Cas9，通过RNA引导对基因进行编辑的细菌适应性免疫系统。II型CRISPR-Cas系统能够对真核生物进行基因编辑，主要包括Cas9、crRNA和trans-activatingcrRNA(tracrRNA)三个元件。gRNA引导Cas9蛋白到达靶序列，形成Cas9/tracrRNA/crRNA复合物，然后切割，切割后的基因组通过转染的重组质粒进行同源重组(homology-directedrepair)或非同源末端连接(nonhomologousendjoining)。其中，II型CRISPR-Cas9系统来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)，已成功用于哺乳动物细胞的编辑。通过CRISPR-Cas9技术建立高效重组病毒载体的系统，较大程度的提高了重组效率，提高了应用价值。目前CRISPR-Cas9已用于在腺病毒(adenovirus)、I型单纯疱疹病毒(typeIherpessimplevirus)和痘病毒(poxvirus)WesternReserve株、Lister株基因组中敲除N1L、A46R等基因，但是还没有应用到我国自主研发的天坛株痘苗病毒上。
技术实现思路
本专利技术针对上述技术问题，经过大量试验细节条件摸索，利用CRISPR-Cas9技术建立一种高效重组痘苗病毒载体。为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种高效重组痘苗病毒载体，其为中国天坛株痘苗病毒缺失TK基因并插入EGFP基因的重组病毒。优选地，上述的高效重组痘苗病毒载体，采用CRISPR-Cas9技术敲除中国天坛株痘苗病毒TK基因。优选地，上述的高效重组痘苗病毒载体，通过转染gRNA-Cas9质粒获得重组病毒或者通过gRNA-Cas9细胞系获得重组病毒。优选地，上述的高效重组痘苗病毒载体，病毒转染用细胞为293T细胞或Hela细胞。本专利技术还提供了上述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，该方法通过转染gRNA-Cas9质粒获得重组病毒。优选地，上述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，包括以下步骤：(1)gRNA-Cas9质粒的构建与鉴定设计靶向TK区的gRNA序列；通过分子克隆方法将px330中Cas9的核定位信号NLS缺失，然后将靶向TK区的gRNA序列导入px330-delNLS，获得带有胞质定位Cas9并靶向TK的gRNA质粒；在293T细胞中转染px330-delNLS、px330-delNLS-gRNA，48h后裂解细胞，通过WesternBlot检测；(2)重组质粒pJ2R-EGFP的构建与鉴定在293T细胞中感染VTT，然后转染pJ2R-EGFP重组质粒；48h后，免疫荧光观察EGFP的表达，构建的重组质粒pJ2R-EGFP主要包括P7.5、P11启动子、EGFP和TK区同源臂；(3)重组病毒VACV-ΔTK-EGFP的筛选在293T细胞密度为60％～70％时，转染gRNA-Cas9质粒；24h后，用DMEM稀释野生型病毒，感染细胞；2h后，转染pJ2R-EGFP；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，收获重组病毒悬液，在Vero细胞中利用病毒噬斑形成实验进行多轮筛选，最终获得纯的重组病毒；(4)重组病毒VACV-ΔTK-EGFP的鉴定提取步骤(3)纯的重组病毒DNA，然后利用PCR扩增验证，再根据PCR产物测序，确证重组病毒在VTT的TK区准确插入EGFP基因。本专利技术还提供了另一种上述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，该方法通过gRNA-Cas9细胞系获得重组病毒。优选地，上述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，包括以下步骤：(1)gRNA-Cas9质粒的构建与鉴定设计靶向TK区的gRNA序列；通过分子克隆方法将Lenti-V2中Cas9的核定位信号NLS缺失，然后将靶向TK区的gRNA序列导入Lenti-delNLS，获得带有胞质定位Cas9并靶向TK的gRNA质粒；在293T细胞中转染Lenti-delNLS、Lenti-delNLS-gRNA，48h后裂解细胞，通过WesternBlot检测；(2)Cas9蛋白在gRNA细胞系中的表达经过嘌呤霉素筛选，最终获得的gRNA-Cas9细胞系中，利用WesternBlot检测；(3)重组病毒的纯化在293T细胞密度为60％～70％时，转染gRNA-Cas9质粒；24h后，用DMEM稀释野生型病毒，感染细胞；2h后，转染pJ2R-EGFP；4h后，换成2％FBS的培养基；48h后，收获重组病毒悬液；在Vero细胞中利用病毒噬斑形成实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，其为中国天坛株痘苗病毒缺失TK基因并插入EGFP基因的重组病毒。

【技术特征摘要】
1.一种高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，其为中国天坛株痘苗病毒缺失TK基因并插入EGFP基因的重组病毒。2.根据权利要求1所述的高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，采用CRISPR-Cas9技术敲除中国天坛株痘苗病毒TK基因。3.根据权利要求2所述的高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，通过转染gRNA-Cas9质粒获得重组病毒或者通过gRNA-Cas9细胞系获得重组病毒。4.根据权利要求3所述的高效重组痘苗病毒载体，其特征在于，病毒转染用细胞为293T细胞或Hela细胞。5.根据权利要求1所述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，其特征在于，该方法通过转染gRNA-Cas9质粒获得重组病毒。6.根据权利要求5所述的高效重组痘苗病毒载体的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)gRNA-Cas9质粒的构建与鉴定设计靶向TK区的gRNA序列；通过分子克隆方法将px330中Cas9的核定位信号NLS缺失，然后将靶向TK区的gRNA序列导入px330-delNLS，获得带有胞质定位Cas9并靶向TK的gRNA质粒；在293T细胞中转染px330-delNLS、px330-delNLS-gRNA，48h后裂解细胞，通过WesternBlot检测；(2)重组质粒pJ2R-EGFP的构建与鉴定在293T细胞中感染天坛株痘苗病毒VTT，2h后，转染pJ2R-EGFP质粒；48h后，免疫荧光观察EGFP的表达，构建的重组质粒pJ2R-EGFP主要包括P7.5、P11启动子、EGFP和TK区同源臂；(3)重组病毒VACV-ΔTK-EGFP的筛选在293T细胞密度为60％～70％时，转染gRNA-Cas9质粒；24h后，用DMEM稀释野生型病毒，...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭斐，许丰雯，张迪，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11