丝裂原活化蛋白激酶依赖性重组痘苗病毒（MD-RVV）及其应用制造技术

提供一种在癌细胞内特异性增殖并破坏癌细胞的痘苗病毒以及提供该病毒在治疗癌症中的应用。一种丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒，所述痘苗病毒的痘苗病毒生长因子(VGF)和O1L的功能缺损，不能在正常细胞内增殖而在癌细胞内特异性增殖，并具有特异性破坏癌细胞的溶瘤性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种新型的痘苗病毒和利用该痘苗病毒的病毒载体。具体而言，涉及一种丝裂原活化蛋白激酶依赖性重组痘苗病毒，所述痘苗病毒是作为病毒蛋白的VGF(痘苗病毒生长因子(vacciniavirusgrowthfactor))和O1L功能缺损的痘苗病毒，可在癌细胞内特异性增殖，具有破坏癌细胞的溶瘤性。
技术介绍
近年来，开发出了将病毒用于治疗癌症的癌症病毒疗法相关的各种技术。作为用于这种疗法的病毒，除了腺病毒、逆转录病毒以外，还有痘苗病毒。痘苗病毒由于其宿主范围广和表达效率高的特点，近年来也一直作为导入有外源基因的表达载体而用作传染病(HIV、SARS)的多价疫苗。另外，还报道了利用痘苗病毒针对癌细胞的溶解性而用于治疗癌症的技术(参照专利文献1)。另一方面，报道了痘苗病毒中激活受感染细胞的ERK而精确控制痘苗病毒增殖的基因是痘苗病毒生长因子(VGF)基因和O1L基因(参照非专利文献1)。关于VGF基因，报道了通过使VGF基因缺失来降低疫苗的致病性(参照非专利文献2)。此外，存在将使VGF基因和TK(胸苷激酶)基因缺损的痘苗病毒应用于治疗癌症的报道(参照专利文献2和非专利文献3)。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第WO2011/125469号国际公开小册子专利文献2：国际公开第WO2013/038066号国际公开小册子非专利文献非专利文献1：SchwenekerM.etal.,JournalofVirology,Vol.86,No.4,pp.2323-2336,2012非专利文献2：BullerRM.etal.,JournalofVirology,Vol.62,No.3,pp.866-874,1988非专利文献3：McCartJA.etal.,CancerResearch,Vol.61,No.24,pp.8751-8757,2001
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在癌细胞内特异性增殖并破坏癌细胞的痘苗病毒以及提供该病毒在治疗癌症中的应用。目前世界上正在积极开展与利用活病毒治疗癌症的癌症病毒疗法相关的临床前研究和临床试验。在痘苗病毒的情形下，在感染初期产生与EGF(表皮生长因子)具有高同源性的痘苗病毒生长因子(VGF)。分泌的VGF与受感染细胞或周围细胞上的EGFR(表皮生长因子受体)相结合，激活Ras/Raf/MEK/ERK代谢途径，由此促进细胞分裂。最近，报道了由痘苗病毒O1L基因所编码的O1L蛋白也可激活受感染细胞内的ERK。认为VGF与O1L激活相同的通路，因此认为使作用于上游的VGF功能缺损时影响较大，而使作用于下游的O1L的功能缺损时影响较小。本专利技术人认为：通过使具有激活ERK功能的基因所编码的蛋白功能缺损，在感染正常细胞时不能激活ERK，因此不能促进细胞分裂，其结果是病毒增殖显著下降，另一方面，在Ras/Raf/MEK/ERK代谢途径被异常激活的癌细胞中，异常激活补偿了病毒的ERK激活功能，病毒增殖并使癌细胞溶解，而且致病性降低，并进行了深入研究。在这种情况下，发现了通过使VGF蛋白与O1L蛋白的两者功能缺损，出乎意料地提高了在正常细胞中的安全性，而且也出乎意料地提高了对癌细胞的溶解性，于是完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。[1]一种丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒，所述痘苗病毒的痘苗病毒生长因子(VGF)和O1L的功能缺损，所述痘苗病毒不能在正常细胞内增殖而在癌细胞内特异性增殖，并具有特异性破坏癌细胞的溶瘤性。[2]根据[1]所述的丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒，其中，痘苗病毒是LC16株、LC16mO株或被修饰的以表达B5R基因的LC16m8株。[3]一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物含有根据[1]或[2]所述的痘苗病毒。[4]一种丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒载体，所述病毒载体在根据[1]或[2]所述的丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒中导入有外源DNA。[5]根据[4]所述的丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒载体，其中，外源DNA是标记DNA，具有细胞毒性效果或免疫激活效果的治疗用基因，或者是编码癌症、病毒、细菌或原虫的抗原的DNA。[6]一种用于治疗癌症或者用作针对癌症、病毒、细菌或原虫的疫苗的药物组合物，所述药物组合物含有根据[4]或[5]所述的丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒载体。本说明书包括作为本申请优先权基础的日本国专利申请2013-241299号说明书和/或附图所记载的内容。附图说明图1是表示通过丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase(MAPK))依赖性重组痘苗病毒，正常细胞不受破坏而癌细胞受到破坏的原理图。图2是表示重组痘苗病毒LC16mO(mO)、LC16mO/VGF-(VGF-)、LC16mO/O1L-(O1L-)和LC16mO/VGF-O1L-(VGF-/O1L-)的结构图。图3是表示在血清存在下，正常细胞与肿瘤细胞中MD-RVV的细胞毒性图。图4是表示在无血清存在下，正常细胞与肿瘤细胞中MD-RVV的细胞毒性图。图5-1是表示在无血清存在下，正常细胞与肿瘤细胞中病毒感染与ERK活性的图。图5-2是表示在血清存在下和无血清存在下，正常细胞和肿瘤细胞中病毒感染与ERK激活的图。图6A是表示在免疫缺陷SCID小鼠中给予病毒后，病毒在体内的分布图。图6B是表示在免疫缺陷SCID小鼠中给予病毒后，增殖病毒的定量结果图。图7是表示在免疫缺陷SCID小鼠中给予病毒后的体重变化图。图8是表示在免疫缺陷SCID小鼠中给予病毒33周后，病毒在体内的分布图。图9是表示在人胰腺癌BxPC3腹膜转移小鼠模型中丝裂原活化蛋白激酶依赖性重组痘苗病毒的抗癌效果图。图10A是表示在BxPC3腹膜转移小鼠模型中给予病毒后，肿瘤在体内的分布图。图10B是表示在BxPC3腹膜转移小鼠模型中给予病毒后，肿瘤增殖的定量结果图。图11是表示在BxPC3腹膜转移小鼠模型中给予病毒后，病毒在体内的分布图。图12是表示在BxPC3腹膜转移小鼠模型中肿瘤特异性病毒增殖与ERK活性图。图12A表示腹膜转移的肿瘤情况，图12B表示肿瘤特异性病毒增殖。此外，图12C表示海肾萤光素酶(RenillaLuciferas本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒，所述痘苗病毒的痘苗病毒生长因子VGF和O1L的功能缺损，所述痘苗病毒不能在正常细胞内增殖而在癌细胞内特异性增殖，并具有特异性破坏癌细胞的溶瘤性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.21 JP 2013-2412991.一种丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒，所述痘苗病毒的痘苗
病毒生长因子VGF和O1L的功能缺损，所述痘苗病毒不能在正常细胞内
增殖而在癌细胞内特异性增殖，并具有特异性破坏癌细胞的溶瘤性。
2.根据权利要求1所述的丝裂原活化蛋白激酶依赖性痘苗病毒，其
中，痘苗病毒是LC16株、LC16mO株或被修饰的以表达B5R基因的
LC16m8株。
3.一种用于治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物含有根据权利
要求1或2所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：中村贵史，
申请(专利权)人：国立大学法人鸟取大学，一般财团法人化学及血清疗法研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP