基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法。所述方法包括如下步骤：(1)将灭活后的口蹄疫病毒细胞培养液进行固液分离后，取上清；(2)将获得的上清进行金属螯合层析，收集洗脱液组分，获得灭活口蹄疫抗原。本发明专利技术的制备工艺稳定，获得的产品纯度高、回收率高，稳定性高，且能够同时满足实验室和生产规模纯化制备灭活口蹄疫病毒抗原的需求。

【技术实现步骤摘要】
基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法
本专利技术涉及疫苗的分离纯化
，具体地，涉及一种基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法。
技术介绍
口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)是一种烈性极强传染病，该病发病主要是由于牛、羊、猪等偶蹄类动物感染口蹄疫病毒(FootandMouthDiseaseVirus，FMDV)所致。口蹄疫病毒具有传染速度快，传播范围广等特点，因此会给畜牧业造成巨大的损失。接种口蹄疫疫苗是目前防治口蹄疫最有效的方法。目前使用的口蹄疫疫苗主要通过将口蹄疫病毒接种到细胞培养液中，后将病毒抗原收获后进行浓缩、灭活，经过膜过滤和PEG沉淀后与缓冲液和相应的佐剂混合制备而成。通过该工艺制备而成的疫苗纯度差，杂质含量多，成分复杂。注射入动物体内后造成免疫保护力差、副反应严重、安全性差等问题。这对目前口蹄疫疫情的控制及整个畜牧业造成了极大的隐患。色谱分离技术是一种获得的样品纯度高、易于工业放大的蛋白质分离纯化技术。目前色谱技术已经广泛用于人用药物的制备，但是在兽用药物领域的应用则尚未普及。目前，已有专利报道了应用色谱技术分离纯化口蹄疫病毒抗原，中国专利技术专利CN102988970B报道了应用凝胶过滤的方法进行口蹄疫病毒抗原的纯化，该方法虽然能获得纯度较高的抗原，但是由于凝胶过滤处理量较小，且对层析柱的柱效具有较高的要求，加之其纯化过程处理时间较长，纯化后抗原浓度会进一步下降，需要后续进行进一步的抗原浓缩，因此该技术在小规模样品制备时具有一定优势，但是由于凝胶过滤技术本身存在的局限性，不适合用于大规模的口蹄疫抗原制备。中国专利技术专利CN104818254A和CN104892734A分别报道了应用离子交换层析和疏水层析进行口蹄疫抗原的制备，上述两种层析方法具有处理量大、耗时短、适用于大规模抗原制备的优点，但是其获得的抗原纯度仍然较低。此外，灭活口蹄疫病毒的结构特殊性使得其纯化过程存在难点。口蹄疫灭活病毒的完整病毒粒子146S具有高的免疫原性，而146S结构稳定性差，容易裂解成为亚基12S，失去免疫活性。因此纯化后的灭活口蹄疫病毒抗原在去除原有培养条件中的杂质成分后，稳定性通常变得更差，保存时间短。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的是提供一种基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。金属离子鳌合亲和层析目前主要用于带标签蛋白的纯化，如镍亲和层析用于带组氨酸(His)标签的蛋白纯化，这些蛋白的组氨酸标签并不是天然存在，主要是通过基因工程的方法修饰形成。而用金属螯合层析直接纯化未经人为添加组氨酸标签的天然蛋白，尤其是超大生物分子如灭活病毒和病毒样颗粒，则鲜有报道。本专利技术提供一种基于金属螯合层析制备口蹄疫病毒抗原的色谱分离方法，该方法基于亲和层析的思路，通过对口蹄疫抗原结构进行分析后发现其抗原表明存在着大量的组氨酸位点，因此采用金属离子作为配基和抗原表面的组氨酸位点特异性结合，而溶液中的杂质蛋白则不与金属离子配基结合穿出色谱柱，从而实现从复杂的组分中特异性捕获口蹄疫病毒抗原。基于金属螯合亲和层析纯化获得的口蹄疫抗原相比于其它方法具有非常高的纯度，杂蛋白去除率到达98％以上，大大提高了疫苗的安全性，且该方法操作简单，工艺重复性好，获得的抗原纯度和收率高。此外，通过实验，专利技术人还惊喜地发现，通过金属离子和抗原颗粒表面组氨酸位点的作用还有利于使各亚基之间作用更为牢固从而增加纯化后口蹄疫病毒抗原颗粒的结构稳定性，因此通过本方法纯化后的抗原相比其它常用层析纯化方法，具有更高的稳定性，保证抗原的有效性。因此，该专利技术能同时适用于实验室和工业化规模的实际应用，具有较大的实用价值。为实现上述目的，根据基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法包括如下步骤：(1)将灭活后的口蹄疫病毒细胞培养液进行固液分离后，取上清；(2)将获得的上清进行金属螯合层析，收集洗脱液组分，获得灭活口蹄疫抗原。根据本专利技术的基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，其中，所述的灭活口蹄疫病毒抗原选自A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia1型中的任一种，优选A型或O型。根据本专利技术的基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，其中，所述固液分离的方法可为本领域常规操作，优选将灭活后的口蹄疫病毒细胞培养液在4℃下以8000-9000rpm的转速离心25分钟后弃去沉淀，保留上清，如此可去除口蹄疫病毒细胞培养液中的杂质，避免其在后续纯化步骤中对层析介质造成污染或损伤。根据本专利技术的基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，其中，在所述的固液分离之后，在所述的将获得的上清进行金属螯合层析之前，还优选对获得的上清进行粗分离处理，获得粗分离组分，以去除病毒细胞培养液中的部分杂质蛋白，从而获得高纯度的灭活口蹄疫病毒抗原。优选地，所述粗分离处理的方法为离子交换层析、疏水层析或PEG沉淀。具体地，各粗分离处理的方法分别优选如下的操作。对于离子交换层析，口蹄疫病毒疫苗抗原在pH高于其等电点时带负电荷，因此可选用阴离子交换层析进行分离，其方法为：将上清通过超滤或透析的方式置换入20mM，pH7.5的磷酸缓冲液，进样到层析柱中，使用含高盐的缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分，获得粗分离组分。或者，对于疏水层析，与杂质蛋白相比，口蹄疫病毒抗原的疏水性较强，因此可以选用疏水层析进行分离，其方法为：室温下加入硫酸铵粉末使得上清组分的电导不低于130mS/cm，进样到层析柱中，使用电导小于5mS/cm的缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分，获得粗分离组分。或者，对于PEG沉淀，加入PEG至上清中，置于4℃过夜沉淀，10000rpm离心10min，将离心后的沉淀溶解于200mM，pH7.5的磷酸盐缓冲液中，复溶后再次10000rpm离心5min，收集上清获得粗分离组分。根据本专利技术的基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，其中所述的金属螯合层析，其具体方法优选如下：先将金属螯合层析柱用平衡缓冲液平衡3-5个柱体积，将步骤(1)获得的上清进样到平衡好的层析柱中，层析过程使用280nm和259nm紫外吸收波长进行蛋白检测，进样的体积为0.5-30倍层析柱体积，优选10-20倍层析柱体积；待进样完后，用平衡缓冲液淋洗层析柱3-5个CV；用含有咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分，从而获得高纯度的灭活口蹄疫病毒抗原。其中，在将步骤(1)获得的上清进样到平衡好的层析柱中的操作中，若在所述的固液分离之后，在所述的将获得的上清进行金属螯合层析之前，还对获得的上清进行粗分离处理，获得粗分离组分，则以获得的粗分离组分进样。粗分离组分中灭活口蹄疫病毒抗原与金属离子配基结合保留在层析柱中，而杂质组分则无法保留，穿透出层析柱。其中，所述金属螯合层析中，使用的金属离子配基为Cu2+、Co2+、Ni2+或Zn2+，优选Cu2+、Ni2+或Zn2+，最优选Ni2+。其中，所述金属螯合层析中，平衡缓冲液系统可选用磷酸盐缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液或柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，优选磷酸盐缓冲液；平衡缓冲液的浓度为0mM-150mM，pH为6.0-9.0，优选浓度10mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，包括如下步骤：(1)将灭活后的口蹄疫病毒细胞培养液进行固液分离后，取上清；(2)将获得的上清进行金属螯合层析，收集洗脱液组分，获得灭活口蹄疫抗原。

【技术特征摘要】
1.一种基于金属螯合亲和层析制备口蹄疫病毒疫苗抗原的方法，包括如下步骤：(1)将灭活后的口蹄疫病毒细胞培养液进行固液分离后，取上清；(2)将获得的上清进行金属螯合层析，收集洗脱液组分，获得灭活口蹄疫抗原。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述的灭活口蹄疫病毒抗原选自A型、O型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型和Asia1型中的任一种，优选A型或O型。3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述固液分离的方法如下：将灭活后的口蹄疫病毒细胞培养液在4℃下以8000-9000rpm的转速离心25分钟后弃去沉淀，保留上清。4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述的固液分离之后，在所述的将获得的上清进行金属螯合层析之前，还对获得的上清进行粗分离处理，获得粗分离组分；所述粗分离处理的方法优选离子交换层析、疏水层析或PEG沉淀。5.根据权利要求1所述的方法，其中所述金属螯合层析的方法如下：先将金属螯合层析柱用平衡缓冲液平衡3-5个柱体积，将步骤(1)获得的上清进样到平衡好的层析柱中，层析过程使用280nm和259nm紫外吸收波长进行蛋白检测，进样的体积为0.5-30倍层析柱体积，优选10-20倍层析柱体积；待进样完后，用平衡缓冲液淋洗层析柱3-5个CV；用含有咪唑的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱组分，从而获得高纯度的灭活口蹄疫病毒抗原。6.根据权利要求5所述的方法，其中，在将步骤(1)获得的上清进样到平衡好的层析柱中的操作中，若在所述的固液分离之后，在所述的将获得的上清进行金属螯合层析之前，还对获得的上清进行粗分离处理，获得粗分离组分，则以获得的粗分离组分...

【专利技术属性】
技术研发人员：张松平，苏志国，林旋，杨延丽，马光辉，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11