曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析制造技术

本发明专利技术提供曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析，包括样本基因组DNA提取，单拷贝基因引物设计，核基因组、线粒体基因组单拷贝基因的实时定量PCR反应标准品制备及标准曲线构建，样本中线粒体基因组拷贝数的检测及含量计算；其中，样本DNA提取方法为：将曼氏无针乌贼组织加入聚丁二酸丁二酯粉末和脂肪醇醚硫酸铵一同研磨，然后经提取、有机溶剂分离、沉淀得样本DNA。本发明专利技术运用荧光定量PCR技术，能够实现对线粒体精确检测及定量，而通过分析曼氏无针乌贼衰老过程肝脏mtDNA拷贝数的变化，有利于为提高产卵率提供解决途径，同时为研究人类衰老提供新的借鉴。

Characteristic analysis of mtDNA copy number in liver of Acanthopanax mansoni during senescence

The present invention provides an analysis of the variation characteristics of mtDNA copy number in liver during senescence of Sepia mansoni, including sample genomic DNA extraction, single-copy gene primer design, preparation of real-time quantitative PCR reaction standard for single-copy genes of nuclear genome and mitochondrial genome and construction of standard curve, detection of mitochondrial genome copy number and content calculation in samples. The method of extraction was as follows: the tissue of Squid Mansoni was ground together with polybutylene succinate powder and fatty alcohol ether ammonium sulfate, and then the sample DNA was extracted, separated and precipitated by organic solvent. The invention uses fluorescence quantitative PCR technology to accurately detect and quantify mitochondria. By analyzing the changes of mtDNA copy number in liver during senescence of Squid Mansoni, it is beneficial to improve oviposition rate and provide a new reference for the study of human senescence.

【技术实现步骤摘要】
曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析。
技术介绍
曼氏无针乌贼(SepiellajaponicaSasaki,1929)是我国东海的“四大海产”之一，上世纪70年代因过度捕捞导致资源严重衰退。曼氏无针乌贼在5～7月成体交配、产卵后即死亡。该乌贼较鱼虾类怀卵量较低，平均怀卵量仅为1778粒，产卵量更低，只有40％，亲本死亡时卵巢中还残留大量卵没有产出，造成了所怀卵的巨大浪费。如何提高曼氏无针乌贼产卵量及延缓其衰老、延长其寿命，是最为亟需解决的问题。然而，目前国内外无曼氏无针乌贼的相关研究报道。乌贼的衰老，与线粒体的变化有着千丝万缕的联系，通过检测曼氏无针乌贼衰老期肝脏线粒体DNA拷贝数的变化，为提高产卵率寻找新的途径，同时为研究人类衰老提供新的借鉴。线粒体几乎存在于所有组织细胞中，是一种独特的由两层膜包被的细胞器，具有半自主性，拥有自身的遗传物质和遗传体系，是细胞中制造能量的结构，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为有机体的“动力工厂”。近年来对线粒体分子生物学的深入研究取得了重要进展，并发现其结构、功能上有许多增龄性变化(衰变)，与脑、心脏、肌肉、内分泌系统及其它组织和衰老有关的功能下降有密切关系。Harman认为人类衰老过程中mtDNA是自由基攻击的主要目标，80年代初Miquel等提出衰老过程是由于氧自由基攻击mtDNA而引起的一个生物过程。1989年Ozawa和Linnane等在线粒体衰老学说中，强调了mtDNA在衰老中所起的核心作用。mtDNA出现突变和删除也会促进衰老。mtDNA是衰老相关体细胞突变的主要靶点，原因在于线粒体的氧化微环境中，mtDNA缺乏保护性组蛋白，且与核DNA相比欠缺有效的修复机制。尽管mtDNA突变的总体水平较低，但衰老细胞个体的突变负荷则较显著，会达到同质性状态，即突变基因组占优势。mtDNA损伤与衰老及增龄性疾病相关的早期证据，是发现mtDNA突变所致人类多系统疾病可模拟某些衰老表型。同时与衰老密切相关的器官蓄力，即重复经历同一段压力时成功恢复原始生理状态的能力，过量的mtDNA拷贝数和串联的端粒DNA重复从分子学角度，为内在嵌入结构复合体能够缓解超额产能提供了额外的例证。线粒体的正常功能依赖于一个完整线粒体基因组，mtDNA功能的完整不仅仅依赖于每一个mtDNA分子结构的完整性，也同时依赖于细胞中mtDNA的拷贝数。mtDNA拷贝数可以反映组织中线粒体的含量，是衡量组织需氧及能量的标志。在一个正常的哺乳动物细胞中，mtDNA通过自身反复合成，其复制从启动至终止与细胞氧化磷酸化代谢过程紧密相关，因而与细胞的正常化长和调亡都极其相关。mtDNA拷贝数变化在胚胎发育及生长过程，不同的细胞和组织中，mtDNA的拷贝数发生不同变化。现有技术如授权公告号为CN102888471B的中国专利技术专利，公开了一种利用SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测类猪圆环病毒P1的方法，该方法包括特异性引物的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化、样本DNA提取及结果检测判定；该专利技术检测灵敏度高，稳定性高、特异性好，可以检测样本中类猪圆环病毒P1的含量，同时可以鉴别样本中猪圆环病毒2型的感染。然而，与本专利技术相比较，本专利技术通过构建以核基因组单拷贝基因β-actin为内参基因，线粒体基因组单拷贝基因COI为目的基因，分析曼氏无针乌贼不同生长时期肝脏线粒体拷贝数的变化特征，其线粒体基因组拷贝数能实现快速及准确地定量检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析，运用荧光定量PCR技术，能够实现对线粒体精确检测及定量，而通过分析曼氏无针乌贼衰老过程肝脏mtDNA拷贝数的变化，有利于为提高产卵率提供解决途径，同时为研究人类衰老提供新的借鉴。本专利技术为实现上述目的所采取的技术方案为：曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析：包括样本基因组DNA提取，单拷贝基因引物设计，核基因组、线粒体基因组单拷贝基因的实时定量PCR反应标准品制备及标准曲线构建，样本中线粒体基因组拷贝数的检测及含量计算。样本基因组DNA提取：采用苯酚-氯仿法，将提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测条带是否清晰，并进行冷冻保藏。单拷贝基因引物设计：以核基因组单拷贝基因β-actin为内参基因，线粒体基因组单拷贝基因COI为目的基因；单拷贝基因用于荧光实时定量PCR分析的引物对分别为：β-actin的正向引物β-actinF序列为：5’-GCCAGTTGCTCGTTACAG-3’，反向引物β-actinR的序列为：5’-GCCAACAATAGATGGGAAT-3’；COI的正向引物COI-F的序列为：5’-GTGCTGGAACTGGATGAA-3’，反向引物COI-R的序列为：5’-AAGGGAGTCGTTCTATTTGT-3’。作为优选，样本DNA提取，包括以下步骤：a.取曼氏无针乌贼组织剪碎，加入组织质量分数为0.1-1％聚丁二酸丁二酯粉末和0.2-0.3％的脂肪醇醚硫酸铵，在液氮中研磨使组织破碎，将研磨后的粉末转移到无菌离心管中，加入预热的SDS提取缓冲液，使研磨后的粉末完全浸没，水浴保温一定时间，水浴保温期间每隔10-15min摇动一次离心管，使研磨后的粉末与提取液充分混匀，得到曼氏无针乌贼组织液；聚丁二酸丁二酯和脂肪醇醚硫酸铵的特殊存在，使得破碎的组织细胞快速溶于SDS提取缓冲液中，对于组织细胞中的糖类、蛋白质具有特异性吸附作用，有利于后续操作中有机溶剂对组织DNA的分离，加之对组织DNA的稳定作用能够抑制DNA降解，因此可有效提高组织DNA分离提取的纯度；b.向步骤a得到的组织液中加入等体积的苯酚后混匀，离心，收集上清液；重复离心操作2-3次，得上清液S1；c.向上清液S1中加入1.2-2倍体积的苯酚-氯仿混合液，苯酚:氯仿的体积比为1:3-3.5，混匀，离心，收集上层水相；重复离心操作2-3次，得上层水相S2；d.向上层水相S2中加入2-3倍体积的异戊醇和0.1-0.5倍体积的1-2M氯化钠溶液，低温下静置沉淀过夜，得沉淀液；e.步骤d中沉淀液经离心，弃上清液，将沉淀物用体积浓度70-75％的酒精洗2-3次，20-25℃干燥0.5-1h，然后用无菌去离子水溶解后于-25～-30℃保存备用。作为优选，SDS提取缓冲液组成为：pH为8.1-8.5的145-150mMTris-HCl，1-2MNaCl，5-10％SDS。作为优选，SDS提取缓冲液的预热温度为50-60℃，水浴保温温度为59-60℃、保温时间为1-1.5h。作为优选，步骤b、c中离心条件为：5-10℃下、6000-8000r/min离心5-8min；步骤e中离心条件为：1-3℃下、8000-10000r/min离心5-10min。作为优选，步骤d中低温沉淀温度为-15～-17℃。本专利技术的有益效果为：1)本专利技术运用荧光定量PCR技术，能够实现对线粒体精确检测及定量，通过分析曼氏无针乌贼衰老过程肝脏mtDNA拷贝数的变化，有利于为提高产卵率提供解决途径，同时本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析，包括样本基因组DNA提取，单拷贝基因引物设计，核基因组、线粒体基因组单拷贝基因的实时定量PCR反应标准品制备及标准曲线构建，样本中线粒体基因组拷贝数的检测及含量计算，其特征在于：样本DNA提取方法为：将曼氏无针乌贼组织加入聚丁二酸丁二酯粉末和脂肪醇醚硫酸铵一同研磨，然后经提取、有机溶剂分离、沉淀得样本DNA。

【技术特征摘要】
1.曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析，包括样本基因组DNA提取，单拷贝基因引物设计，核基因组、线粒体基因组单拷贝基因的实时定量PCR反应标准品制备及标准曲线构建，样本中线粒体基因组拷贝数的检测及含量计算，其特征在于：样本DNA提取方法为：将曼氏无针乌贼组织加入聚丁二酸丁二酯粉末和脂肪醇醚硫酸铵一同研磨，然后经提取、有机溶剂分离、沉淀得样本DNA。2.根据权利要求1所述的曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析，其特征在于：所述样本DNA提取，包括以下步骤：a.取曼氏无针乌贼组织剪碎，加入组织质量分数为0.1-1％聚丁二酸丁二酯粉末和0.2-0.3％的脂肪醇醚硫酸铵，在液氮中研磨使组织破碎，将研磨后的粉末转移到无菌离心管中，加入预热的SDS提取缓冲液，使研磨后的粉末完全浸没，水浴保温一定时间，水浴保温期间每隔10-15min摇动一次离心管，使研磨后的粉末与提取液充分混匀，得到曼氏无针乌贼组织液；b.向步骤a得到的组织液中加入等体积的苯酚后混匀，离心，收集上清液；重复离心操作2-3次，得上清液S1；c.向上清液S1中加入1.2-2倍体积的苯酚-氯仿混合液，苯酚:氯仿的体积比为1:3-3.5，混匀，离心，收集上层水相；重复离心操作2-3次，得上层水相S2；d.向上层水相S2中加入2-3倍体积的异戊醇和0.1-0.5倍体积的1-2M氯化钠溶液，低温下静置沉淀过夜，得沉淀液；e.步骤d中沉淀液经离心，弃上清液，将沉淀物用体积浓度70-75％的酒精洗2-3次，20-25℃干燥0.5-1h，然后用无菌去离子水溶解后于-25～-30℃保存备用。3.根据权利要求2所述的曼氏无针乌贼衰老过程中肝脏mtDNA拷贝数的变化特征分析，其特征在于：所述SDS提取缓冲液组成为：pH为8.1-8.5的145-150mMTris-HC...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭宝英，黄幻清，祁鹏志，叶莹莹，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33