DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法技术

本发明专利技术公开了一种DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法，以中国西门塔尔牛DLK1基因的DNA序列为模板，设计一对引物，进行严格的PCR反应体系进行样品的PCR扩增和电泳，通过测序筛查并找到2个SNP位点；群体中筛查DLK1‑478 C/T位点的限制性内切酶为Msp I，该酶限定的切割碱基为CCGG;筛查DLK1‑609 T/G位点的限制性内切酶为Ase I；中国西门塔尔牛群体中携带DLK1‑478 C/T位点T等位基因和TT突变基因型个体具有较高的脂肪覆盖率和较好的大理石花纹；及携带DLK1‑609 T/G位点的G等位基因和GG突变基因型个体具有较高的脂肪覆盖率。本发明专利技术DLK1基因两个突变位点可以作为预示中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状遗传标记，用于肉用牛早期标记辅助选择。

Detection of Carcass Fat Coverage in Simmental Cattle by DLK1 Gene Marker

The invention discloses a method for detecting carcass fat coverage of Simmental cattle by DLK1 gene marker. A pair of primers are designed based on DNA sequence of DLK1 gene of Chinese Simmental cattle as template, and a strict PCR reaction system is used for sample amplification and electrophoresis. Two SNP loci are screened by sequencing and two SNP loci are found. The restrictive endonuclease for screening DLK1 C/T loci in population is Msp I. The restriction endonuclease for screening DLK1 609 T/G locus was Ase I; individuals carrying DLK1 478 C/T locus T allele and TT mutant genotype in Chinese Simmental cattle population had higher fat coverage and better marble pattern; and individuals carrying DLK1 609 T/G locus G allele and GG mutant genotype had higher fat content. Coverage rate. The two mutation sites of DLK1 gene of the invention can be used as genetic markers for predicting fat coverage and marble pattern traits of Chinese Simmental cattle, and can be used for early marker-assisted selection of beef cattle.

【技术实现步骤摘要】
DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法
本专利技术公开一种DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法，利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花性状，属于检测牛肉质性状

技术介绍
中国西门塔尔牛肉色鲜红、纹理细致、富有弹性、大理石花纹适中、脂肪色泽为白色或带淡黄色、脂肪质地有较高的硬度、体表脂肪覆盖率100%，普通的牛肉很难达到这个标准。从基因角度，利用分子的遗传标记作为对牛肉品质性状研究的主要手段，筛查由微效多基因控制的数量性状，来优化牛群的选育。单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphisms，缩写SNP），是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入，形成的遗传标记，其数量很多，多态性丰富。从理论上来看每一个SNP位点都可以有4种不同的变异形式,但实际上发生的只有两种，即转换和颠换。SNP技术为当前应用最广泛的遗传标记技术之一，在动物遗传育种研究方面发挥重要作用。DLK1（daltalikenon-canonicalNotchligand1）基因是一个父源表达的印记基因，是表皮生长因子（Epidermalgrowthfactor,EGF）家族中的一员，在细胞膜外含有6个串联的EGF结构域,DLK1蛋白为跨膜糖蛋白。在NCBI网站里查询获得，家牛的DLK1位于21号染色体，有6个外显子。DLK1有可变剪接体，其中牛剪接体有DLK-1-A,DLK-1-C2，DLK-1-E等，牛DLK1mRNA至少存在四种可变剪切形式，并且这四种可变剪切都是由第五个外显子部分核苷酸缺失而造成。DLK1在脂肪形成、血细胞的生成、肺脏发育、肾上腺及神经内分泌的分化等过程中有调节作用。除了调节细胞分化（如脂肪形成和成骨）之外，DLK1还是Notch信号传导的负调控因子和细胞干细胞的调节剂。近年来有研究表明，脂肪组织可以分泌多种因子（细胞因子）来参与人体的一些生理活动，如免疫反应和能量代谢平衡等。DLK1作为一个重要的抑制脂肪分化的因子，也逐渐被人们所重视。迄今为止，未有报道表明DLK1基因的遗传标记可作为肉牛育肥前筛选优良肉质性状的辅助选择分子标记。
技术实现思路
本专利技术提供了一种DLK1基因标记检测西门塔尔牛胴体脂肪覆盖率的方法，解决了当前对牛脂肪覆盖率和大理石花纹肉质性状相关的重要分子遗传标记筛查的难题。本专利技术所述的一种检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的基因，其特征在于：其基因序列为SeqIDNO.1所示；序列的第I3-478bp处，478C突变为478T，导致MspI-RFLP多态性；序列的第I3-609bp处，609T突变为G，导致AseI-RFLP多态性。本专利技术所说的一种利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的方法，其特征在于PCR扩增中国西门塔尔牛DLK1基因遗传标记的引物对如下所示：DLK1正向引物F：5′-TCCACAGTGGAGGCTACTAAG-3′；DLK1反向引物R：5′-CTTGTCTCCTGACTTCCTAAG-3′；从中国西门塔尔牛血液中提取基因组DNA，以其为模板，用上述引物对进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，后测序，获得DLK1基因及DLK1-478C/T和DLK1-609T/G的两个单核苷酸碱基突变。经筛查分析，两个的限制性内切酶分别为MspI和AseI，识别的核苷酸酶切位点，MspI为CCGG；Ase1为ATTAAT。利用PCR-RFLP方法可在中国西门塔尔牛群体中进行DLK1基因遗传突变位点检测。利用PCR-RFLP方法对中国西门塔尔牛群体中DLK1基因2个遗传突变位点进行检测。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认长度为489bp，用限制性内切酶MspI和AseI进行特异性酶切以确认群体中两个遗传标记的基因频率和基因型频率分布。限制性内切酶的酶切体系为15ul，包括cutsmartbuffer1.5ul，MspI或AseI酶0.3ul，PCR产物4ul，ddH2O9.2ul。于37℃条件下酶切2h。酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认中国西门塔尔牛群体中每个个体所携带的基因型。该基因标记的核苷酸序列为SeqIDNO.1所示序列的第I3-478bp处，478C突变为478T，导致MspI-RFLP多态性；序列的第I3-609bp处，609T突变为G，导致AseI-RFLP多态性。本专利技术的积极效果在于：公开了DLK1基因的遗传标记可作为肉牛育肥前筛选优良肉质性状的辅助选择分子标记用途；并提供了一对引物及2个SNP位点分别是I3-478C/T和I3-609T/G作为预示中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状遗传标记，用于肉用牛早期标记辅助选择。附图说明图1为中国西门塔尔牛DLK1基因引物对PCR扩增产物电泳图；图2为本中国西门塔尔牛资源群体测序获得的DLK1基因SNPs；图3为单个中国西门塔尔牛DLK1基因引物对PCR扩增产物电泳图；图4为PCR扩增产物MspI酶切电泳图，AseI酶切电泳图。具体实施方式通过以下实施例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术，在不背离本专利技术的技术解决方案的前提下，对本专利技术所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本专利技术的权利要求范围之内。实施例1中国西门塔尔牛DLK1基因片段的获得及功能区域多态性检测方法的建立：1.1试验材料：237头28月龄中国西门塔尔牛公牛来自内蒙古通辽市宝龙山肉牛育肥场。颈静脉采血，所采血样均为10mL/头，用ACD抗凝剂抗凝，-20℃冻存。用血液基因组DNA提取试剂盒从血样中提取基因组DNA；1.2引物设计及PCR扩增：选择中国西门塔尔牛为试验材料，为了尽可能多的检测SNPs位点，选取SNP密度较高的片段，根据选取的牛DLK1基因序列设计以下引物对：正向引物F：5′-TCCACAGTGGAGGCTACTAAG-3′；反向引物R：5′-CTTGTCTCCTGACTTCCTAAG-3′；用上述引物对在中国西门塔尔牛基因组中进行PCR扩增；PCR扩增反应为25μL体系，包括：上、下游引物各0.5μL；GreenMix12.5μL；DNA模板2μL；ddH2O9.5μL；PCR扩增反应程序：94℃变性5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，进行35个循环；最后72℃延伸10min；PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认长度为489bp（图1示）；PCR扩增产物进行测序和序列比对分析(图2示)；DLK1基因共包含2个SNPs位点：DLK1-478C/T、DLK1-609T/G存在碱基突变。1.3对单个样品进行扩增：利用PCR-RFLP方法对中国西门塔尔牛群体中DLK1基因2个遗传突变位点进行检测。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测确认长度为489bp（图3示），用限制性内切酶MspI和AseI进行特异性酶切以确认群体中两个遗传标记的基因频率和基因型频率分布；限制性内切酶的酶切体系为15ul，包括cutsmartbuffer1.5ul，MspI或AseI酶0.3ul，PCR产物4ul，ddH2O9.2ul。于37℃条件下酶切2h。酶切产物经1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的基因，其特征在于：该基因序列为Seq ID NO.1所示；序列的第I3‑478bp处，478C突变为478T，导致MspI‑RFLP多态性；序列的第I3‑609bp处，609 T突变为G，导致AseI‑RFLP多态性。

【技术特征摘要】
1.一种检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的基因，其特征在于：该基因序列为SeqIDNO.1所示；序列的第I3-478bp处，478C突变为478T，导致MspI-RFLP多态性；序列的第I3-609bp处，609T突变为G，导致AseI-RFLP多态性。2.一种利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的方法，其特征在于PCR扩增中国西门塔尔牛DLK1基因遗传标记的引物对如下所示：正向引物F：5′-TCCACAGTGGAGGCTACTAAG-3′；反向引物R：5′-CTTGTCTCCTGACTTCCTAAG-3′。3.如权利要求2所述一种利用DLK1基因标记检测中国西门塔尔牛脂肪覆盖率和大理石花纹性状的方法，包括以下步骤：以中国西门塔尔牛血液中提取基因组DNA为模板，用权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，PCR产物纯化、克隆测序，获得如权利要求1所述的D...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨润军，王梦岩，赵志辉，房希碧，余湘，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22