一种用于鉴别厚壳贻贝与紫贻贝杂交子一代的分子标记及其引物与应用制造技术

本发明专利技术属于水产动物分子标记和杂交种鉴定技术领域，具体是一种鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记及其引物与应用。杂交子一代的分子标记的核苷酸序列如SEQ 1和SEQ 2所示。扩增该分子标记的引物核苷酸序列如SEQ 3和SEQ 4所示。PCR产物同时具有SEQ 1和SEQ 2所示核苷酸序列的样本为厚壳贻贝(♀)X紫贻贝(♂)的杂交子一代。本发明专利技术从基因层面提供了一种鉴别厚壳贻贝(♀)X紫贻贝(♂)杂交子一代的方法，有效地避免了外观形态难以区分、背景来源不明确等造成的难以鉴定区分的问题，具有准确、高效、快速、简便的优点，为人工育苗中种贝的遗传鉴别等提供技术支持。

A Molecular Marker for Identification of Hybrid Generation of Mussel Thickshell and Mussel Purple and Its Primers and Applications

The invention belongs to the technical field of aquatic animal molecular marker and hybrid identification, in particular to a molecular marker and its primer and application for identifying the hybrid generation of mussel () and mussel (). The nucleotide sequences of molecular markers in the hybrids are shown in SEQ 1 and SEQ 2. The primer nucleotide sequence of the molecular marker was amplified as shown in SEQ 3 and SEQ 4. The samples with both SEQ-1 and SEQ-2 nucleotide sequences were the hybrids of mussel () X mussel (). The invention provides a method for identifying the hybrid generation of thick shell mussel () X purple mussel () from the gene level, effectively avoids the difficult identification problems caused by difficult appearance and unclear background source, has the advantages of accuracy, efficiency, rapidity and simplicity, and provides technical support for genetic identification of breeding shellfish in artificial breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别厚壳贻贝与紫贻贝杂交子一代的分子标记及其引物与应用
：本专利技术属于水产动物分子标记和杂交种鉴定
，具体是一种鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记及其引物与应用。
技术介绍
：厚壳贻贝(Mytiluscoruscus)和紫贻贝(M.galloprovincialis)是双壳纲、贻贝目、贻贝科、贻贝属的两种常见贻贝，广泛分布在我国沿海，是重要的养殖经济贝类。2017年，我国贻贝养殖产量92.76万吨，仅次于牡蛎、蛤类和扇贝，是我国第三大养殖贝类。主要养殖种类涉及厚壳贻贝、紫贻贝和翡翠贻贝(Pernaviridis)，其中厚壳贻贝与紫贻贝的产量总和超过贻贝总产量的85％。厚壳贻贝的养殖主要集中在浙江、福建等南方海区，养殖用苗以人工育苗为主，少数采用野生苗；紫贻贝的养殖主要集中在辽宁、山东等北方沿海，养殖苗种完全依赖野生苗种。自然状态下，两种贻贝在我国南北沿海均有发现，生态位有重叠，实验证明两者可发生杂交。在厚壳贻贝的人工育苗生产中，也出现了子代生长慢、个体小，齐性差等问题，可能是种贝的种质已经受到污染，后代产生了性状分离。由于两种贻贝及自交后代的壳形相近，可塑性高，在进行种贝挑选时单凭外形难以进行区分，这严重困扰了厚壳贻贝的人工育苗及养殖生产的有序开展。目前，鉴定贝类种类的方法主要有两种：一种是采用外部形态特征进行鉴定的传统方法，由于壳形相近且可塑性高，可靠性一度受到质疑，更不适用于杂交后代的鉴定；二是采用分子生物学方法，利用某些线粒体基因或核基因序列进行物种鉴定，已有报道涉及厚壳贻贝和紫贻贝的物种鉴定，但由于紫贻贝在遗传上具有特殊性，线粒体的双单亲遗传，且部分基因的协同进化，进而增加了杂交鉴定基因筛选的难度，并且迄今为止，未见对两者杂交子代进行鉴定的报道，可见建立一种厚壳贻贝与紫贻贝杂交子代鉴定的方法是十分有必要的。
技术实现思路
：为解决上述问题，有效鉴定人工育苗阶段厚壳贻贝种贝的遗传背景，本专利技术提供了一种用于鉴定厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记及其引物与应用。为达到上述目的，本专利技术采取的具体技术方案为：一种用于鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记，杂交子一代的分子标记的核苷酸序列如SEQ1和SEQ2所示。一种用于鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记的引物对，所述分子标记的引物如SEQ3和SEQ4所示，其中：上游引物的核苷酸序列如SEQ3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ4所示。一种用于鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记的应用，所述SEQ1和SEQ2碱基所示分子标记在鉴别厚壳贻贝(♀)X紫贻贝(♂)杂交子一代中的应用。通过所述SEQ3和SEQ4碱基所示的引物对待检测样品进行PCR扩增，产物中出现95bp和143bp两条片段，待测样品即为厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)的杂交子一代。一种鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的方法，通过所述SEQ3和SEQ4碱基所示的引物对待检测样品进行PCR扩增，扩增产物经测序后同时具有SEQ1和SEQ2所示碱基序列，则待测样品即为厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)的杂交子一代。具体为：1)提取待测样本的基因组DNA；2)以待测样本的基因组DNA为模板，利用如SEQ3和SEQ4所示的引物进行PCR扩增反应，获得PCR产物；3)利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，若只得到约95bp的单一片段，则待测样本为紫贻贝；若得到长度约143bp的单一片段，则待测样本为厚壳贻贝；若同时得到95bp和143bp两条片段，则待测样本为厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)的杂交子一代；所述PCR扩增反应体系为：基因组DNA(50ng/uL)2uL，PremixTaq(TaKaLa)10uL，上游引物(10ul/L)0.5uL,下游引物(10ul/L)0.5uL,ddH2O7uL组成的20uL反应体系。所述PCR扩增反应条件为95℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃终延伸5min。本专利技术具有的优点：本专利技术从基因层面提供了鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的方法，有效地避免了外观形态难以区分、背景来源不明确、遗传上的特殊性等造成的难以鉴定区分的问题，具有准确、高效、快速、简便的优点，为人工育苗中种贝的遗传鉴别提供技术支持。附图说明：图1为实施例1中部分待测样本PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。泳道1,18为marker，泳道2-6为紫贻贝样本，泳道7-11为杂交子一代样本，泳道12-16为厚壳贻贝样本。具体实施例以下结合实例对本专利技术的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本专利技术，并不局限于本专利技术。实施例1：本专利技术分子标记与引物的核苷酸序列的获得。从NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中分别获得厚壳贻贝(D63777.1)和紫贻贝(KY549939.1)目的基因序列，通过遗传上的特殊性等特点设计序列比对，使用premier5.0软件设计扩增该目的基因的上下游引物。SEQ1与SEQ2分别为所述分子标记核苷酸序列，SEQ3与SEQ4分别为上游引物与下游引物核苷酸序列。SEQ1:AAAGTTATCCGGCACCATATAAACCGAAAGGCTATTATCCTACGAAACGTTATCAGCCAACATATGGATCAAAGACAAACTATCCGCCAATATATAAGCCAATTGCAAAGAAGCTATCATCATACAAACCATTAAGACTCTAGSEQ2:CCCTACGAATAGTTATCCGCCAACATATGGATCAAAGACAAACTATCTGCCACTTGCAAAGAAGCTTTCATCATACAAACCATTAAGACTCTAGASEQ3:5’-CCAGTATATAAACCTGTGA-3’SEQ4:5’-GTCTTAATGGTTTGTATGAT-3’实施例21.待测样本：实验室培育获得的厚壳贻贝、紫贻贝及厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)的杂交子一代幼虫各30个，保存于无水乙醇中。2.待测幼虫DNA提取与浓度测定:幼虫从酒精中转移至载玻片上，待酒精完全挥发后，用灭菌纯水将幼虫清洗几遍。将单个幼虫转移至PCR管中，PCR管中内含10ul的STE溶液(100mMNaCl；10mMTris-Cl[pH8.0]；1mMEDTA[pH8.0]；0.5mg/ml蛋白酶K)。含有幼虫的PCR管首先置于56℃加热30min，以破裂细胞，释放DNA。然后，置于95℃加热10min，以灭火蛋白酶K。用Nanodrop检测待测幼虫DNA的质量与浓度，统一稀释至30ng/uL.3.PCR扩增：以提取的待测幼虫DNA为模板，以SEQ3与SEQ4为上下游引物进行PCR扩增，反应体系为：DNA模板(30ng/uL)2uL，PremixTaq(TaKaLa)10uL，上游引物(10ul/L)0.5uL,下游引物(10ul/L)0.5uL，ddH2O7uL组成的20uL反应体系。扩增反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记，其特征在于：杂交子一代的分子标记的核苷酸序列如SEQ 1和SEQ 2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记，其特征在于：杂交子一代的分子标记的核苷酸序列如SEQ1和SEQ2所示。2.一种用于鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记的引物对，其特征在于：所述分子标记的引物如SEQ3和SEQ4所示，其中：上游引物的核苷酸序列如SEQ3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ4所示。3.一种权利要求1所述的用于鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记的应用，其特征在于：所述SEQ1和SEQ2碱基所示分子标记在鉴别厚壳贻贝(♀)X紫贻贝(♂)杂交子一代中的应用。4.按权利要求3所述的用于鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的分子标记的应用，其特征在于：通过所述SEQ3和SEQ4碱基所示的引物对待检测样品进行PCR扩增，产物中出现95bp和143bp两条片段，待测样品即为厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)的杂交子一代。5.一种鉴别厚壳贻贝(♀)与紫贻贝(♂)杂交子一代的方法，其特征在于：通过所述SEQ3和SEQ4碱基所示的引物对待检测样品进行PCR扩增，扩增产物经测序后同时具有SEQ1和SEQ2所示碱基序列，则待测样品即为厚壳贻贝(♀)与紫贻...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘明坤，杨林颖，阙华勇，张国范，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37