本发明专利技术公开一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用及其试剂盒，筛选出一个火鸡通用基因Gcg，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其位于火鸡基因组染色体上，单拷贝易定量，在火鸡基因组中拷贝数恒定，不存在等位基因变异，以该基因为靶序列，引入特异性引物和探针作为试剂盒，可快速、灵敏地检测食品中的火鸡源性成分，灵敏度高，特异性强，操作简单、成本低廉，反应结果易于观察，非常适用于现场实时检测，在动物源性食品监督与精准检测肉制品掺假方面应用前景广阔。
Application of a Gene Gcg in Detecting Turkey Derived Components and Its Kit
The invention discloses the application of a gene Gcg in the detection of Turkey derived ingredients and its kit, and screens out a common Turkey gene Gcg, whose nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1. It is located on the chromosome of Turkey genome, and its single copy is easy to quantify. The number of copies is constant in Turkey genome, and there is no allele variation. The gene is used as the target sequence, and specific primers and alleles are introduced. As a kit, the probe can quickly and sensitively detect turkey-derived ingredients in food with high sensitivity, specificity, simple operation, low cost and easy observation of reaction results. It is very suitable for real-time detection in the field. It has broad application prospects in animal-derived food supervision and accurate detection of meat adulteration.
【技术实现步骤摘要】
一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用及其试剂盒
本专利技术涉及生物物种鉴定和PCR检测
，具体的说涉及一种用于检测火鸡成分的内标准基因及其应用。
技术介绍
随着社会经济和产品技术加工的发展，很多食品被非法添加各种化学原料、添加剂、激素等，甚至很多商家为谋求高额利益进行食品掺假行为或直接以次充好，这严重危害了消费者的利益和身体健康，因此对食品种类的准确鉴定至关重要。火鸡作为国外传统节日的主食，是一种高蛋白、低脂肪的超级营养食物，蛋白质含量高达30%，与家鸡相比，火鸡的肉质略粗一些，但营养价值较高。在中国人的营养元素组成中，主要缺乏的就是蛋白质指标，而火鸡的引入恰恰可以弥补这一缺陷。在美国，由火鸡肉和其他肉类混合制成的肉类加工品已经被广大消费者接受。而美国正扩大中国市场，使火鸡肉和其他肉类混合制成的肉类加工品更多地出现在中国消费者的餐桌上，我国火鸡的饲养数量也逐渐上升。然而越来越多的商家为获取高额利益，用激素和抗体喂养禽类，使其加速增长，饲养过程中在禽饲料中添加禽成分存在传播禽流感的风险，影响畜禽健康生产，威胁畜牧业安全。更有不法商家用便宜的肉制品甚至蛋白制品掺假火鸡肉，以谋取暴力等。而火鸡肉污染可能引发严重食品安全问题，利用火鸡的内标准基因和分子技术检测火鸡肉掺假是一种有效的检测手段。目前，内标准基因已被广泛地用于鉴别食品掺假，但如何筛选出合适的内标准基因显得尤为重要。目前国内外的肉制品掺假检测技术多是针对线粒体上的基因设计特异引物来进行实时荧光定量PCR扩增，由于线粒体基因为多拷贝基因，其检测灵敏度高，但同时在区分由于销售、运输等过程所产生的无意识交叉污染与有意识的非法添加时存在困扰。另外，高拷贝数线粒体DNA的浓度无法和基因组DNA的浓度相对应，因此无法对样品进行精确定量分析，同时由于线粒体基因同源性极高，难以通过普通PCR实现定性检测。因此，该方法只能借助荧光定量PCR实现肉类掺假的筛选鉴别。若要鉴别低浓度的无意交叉污染和有意非法添加并明确掺假比例实现快速筛查，则要选择染色体上的低拷贝基因作为肉类内标准基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用，以基因Gcg作为内标准基因，该内标准基因Gcg在食品或饲料中的火鸡成分鉴定中的应用，基因Gcg的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术还提供一种用于检测火鸡源性成分的试剂盒，以基因Gcg为靶基因建立的试剂盒，包括基因Gcg的特异性引物，采用PCR方法检测内标准基因Gcg的特异性引物，特异性引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，本专利技术提供上述特异性引物在检测火鸡源性成分中的应用。所述试剂盒还包括探针，探针的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术是以Gcg基因作为内标准基因在检测火鸡源性成分中的应用，首次在染色体上筛选出火鸡源性内标准基因，且拷贝数为单拷贝。内标准基因的选择一般要求拷贝数低且稳定，一般动物内标准基因常选择在线粒体上，这样的基因拷贝数多，不易于定量。本专利技术选择染色体上的基因做为内标准基因，其拷贝数地易于定量，相比于线粒体上的基因，突变率更低。本专利技术采取southern杂交的方式，进行拷贝数的鉴定，Xba1和BamH1酶切的DNA片段中均出现两条条带，将火鸡特异性片段在Ensembl基因信息数据库中比对，除了存在于染色体7号上外，该片段中的39bp片段在1号染色体上也存在，因此southern杂交出现两条条带。但所需要的完整的目的片段只存在于火鸡的7号染色体上，进而确定了目标Gcg基因的拷贝数为单拷贝。基于本专利技术确定的用于检测食品及饲料中火鸡源成分的内标准基因Gcg，本专利技术设计了用于检测该基因的定性PCR和定量PCR的引物和/或探针，建立了检测火鸡源性成分的相应PCR方法，该方法费时少，特异性好，灵敏度高，操作简单，不需要专业人员操作，结果易于观察，非常适于基层食品监督检验使用。附图说明图1为基因同源性分析；图2为火鸡的Southern杂交结果（图中1-Xba1酶切火鸡基因组DNA；2-BamH1酶切火鸡基因组DNA）。图3为Gcg基因的定性PCR验证特异性（泳道1-23，图1-驴；2-鸭；3-羊；4-野鸡；5-猪；6-牛；7-火鸡；8-马；9-普通家鸡；10-乌鸡；11-鹅；12-狗；13-兔；14-鼠；15-鱼；16-牦牛；17-水牛；18-骆驼；19-貂；20-鹿；21-人；22-猴；23-阴性；M-DNAMarkerDL2000）；图4为Gcg基因的定量PCR验证特异性（其中1是火鸡）；图5为Gcg基因的荧光定量PCR扩增曲线（其中1为100ng/μL，2为10ng/μL，3为1ng/μL，4为0.1ng/μL，5为0.01ng/μL，6为阴性，每个浓度做三个平行）；图6为Gcg基因的荧光定量PCR标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例进一步说明本专利技术的内容，但不应理解为对本专利技术的限制，在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。猪(Susscrofa),牛(Bostaurus)，羊(Ovisaries)，普通家鸡(Gallusgallus)，野鸡（Phasianuscolchicus），火鸡（Meleagrisgallopavo），乌鸡(Gallusdomesticusbrisson)，鸭(Anasplatyrhynchos)，鹅(Goosecalicivirus),狗(Canislupusfamiliaris)，兔(Oryctolaguscuniculus)，牦牛(Bosmutus)，黄鱼（Pseudosciaenapolyactis）为超市购买；马(Equuscaballus)，驴(Equusasinus)为北京农贸市场购买；老鼠(Musmusculus)由中国农业大学食品安全与分子生物学实验室提供。水牛(Bubalusbubalis)，貂(Marteszibellina)，骆驼(Camelusferus)，鹿(Cervus)由天津出入境检验局的李宗梦博士提供；猴(Macacafascicularis)由中国农业科学院动物所提供；人(Homosapiens)胎盘组织由空军总医院提供。实施例1火鸡源通用内标准基因Gcg的筛选通过搜索GenBank中关于火鸡的基因信息，对基因信息进行BLASTn和DNAman软件同源性、特异性分析，筛选出Gcg基因，位于火鸡基因组染色体7号上，由图1所示，经BLASTn序列同源性分析，此Gcg基因片段在数据库中基因同源性最低；将火鸡的Gcg基因片段与非火鸡物种DNA序列进行多序列特异性分析，具有较高的火鸡源特异性；最后通过对序列进行整合，确定最终的特异性目标基因Glucagon（Gcg）基因可以作为内标准基因；该Gcg基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。实施例2火鸡源性成分通用内标准基因的验证1、针对实施例1筛选的内部基因Gcg，通过PrimerExpress3.0设计软件（美国生命技术公司）针对Gcg基因设计PCR及定量PCR引物和探针：Gcg-F:CTTTTATCAGGTTTTTTTT本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用，基因Gcg的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种基因Gcg在检测火鸡源性成分中的应用，基因Gcg的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种用于检测火鸡源性成分的试剂盒，其特征在于，包括Gcg的特异性引物，特异性引...
【专利技术属性】
技术研发人员：商颖，许文涛，葛长荣，黄昆仑，廖国周，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
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