一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法技术

本发明专利技术涉及一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，属分子标记领域。首先剪取真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代尾鳍样品，进行DNA的提取，然后以亲本和杂交后代的DNA为模板，采用微卫星标记引物进行多重PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，用BandScan5.0软件分析，结合PCR产物长度判断等位基因大小，确定个体基因型，根据分析结果建立杂交鲷及亲本的基因型数据文件；利用Cervus3.0软件进行家系判别。本发明专利技术采用微卫星标记技术，在10个微卫星座位上区分杂交用雌雄亲本和后代基因型，可以准确、便捷地确定杂交鲷后代的家系来源，快速高效地选育出优良的杂交鲷家系，为遗传育种工作带来极大的便利。

A Method for Identification of Hybrid Sparus Families by Microsatellite Markers

The invention relates to a method for identifying hybrid sparrow families by using microsatellite markers, belonging to the field of molecular markers. First, the tail fin samples of the male and female offspring of the red snapper and the black sea bream were extracted, and then the DNA was extracted. Then the multiplex PCR was amplified by microsatellite primers using the parent DNA and the DNA of the hybrids as the template. The amplified products were analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis and the length of the PCR product was used to determine the allele size, and the individual genotype was determined. Genotype data files of hybrid pomfret and its parents were established based on the analysis results. Family identification was carried out by using Cervus 3.0 software. The present invention uses microsatellite marker technology to distinguish male and female parents and offspring genotypes for hybridization on 10 microsatellite loci. It can accurately and conveniently determine the family origin of offspring of hybrid sparrow, quickly and efficiently select excellent hybrid sparrow families, and bring great convenience to genetic breeding work.

【技术实现步骤摘要】
一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法
本专利技术涉及一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，属于分子标记

技术介绍
黑鲷(Acanthopagrusschlegelii)体形为长椭圆形、侧扁，体态优雅、色泽素丽、肉质鲜美，是一种名贵的海产鱼类。黑鲷鱼的抗逆性强，对温度、盐度适应范围广，但养殖周期长、抗病力差。近年来由于没有对种鱼进行选育和改良，种质资源已经开始出现衰退，病害日趋严重、品质下降，经济效益明显下滑，影响了黑鲷养殖业的稳定与持续发展。真鲷(Pagrosomusmajor)为近海暖温性底层肉食性鱼类，具有生长快、便于暂养、经济价值高等特点，是一种名贵的海水养殖鱼种。近年来，真鲷的人工养殖试验已取得了一定的成果，在我国南方沿海地区已经发展成为一种主要的海水养殖鱼种。但真鲷抗逆性差、不耐低温。因此，可以期望通过杂交育种的方式，将真鲷与黑鲷进行杂交，使得杂交鲷产生杂种优势，克服亲本不耐低温、生长偏慢的缺点。2014、2015年江苏省海洋水产研究所科研人员在江苏省海水增养殖技术及种苗中心开展了真鲷黑鲷的杂交育种技术研究，以真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼为亲本，采用人工授精的方法，成功获得了杂交后代，建立了杂交鲷家系。杂交后代具有体型标准、生长快、易起捕、不饱和脂肪酸含量高等特点，是沿海海水鱼类试验养殖的对象。在鱼类良种选育过程中，搞清楚种群中的亲子关系或系谱关系，能够避免种群(个体)发生近交。因此，对杂交鲷家系进行鉴定非常重要，有了杂交鲷家系材料，可以开展鲷鱼生长、抗逆、脂肪酸含量等生物学特性遗传力计算，随后对各性状的育种值进行估计，以指导海水鲷鱼新品种的培育。但水产动物由于难以标识、不易从外部特征鉴别，传统鉴别方式难以发挥作用。微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)，又称简单重复序列(SimpleSequenceRepeats,SSR)或短串联重复序列(ShortTandemRepeats,STR)，是指以1～6bp的短核苷酸为基本单元，首尾相接组成的串联重复序列，由核心序列和两侧的侧翼序列所构成。微卫星DNA广泛分布于真核生物基因组中，且因具有多态性高、重复性好、易于检测、共显性等特性，被广泛应用于海洋生物的遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传连锁图谱构建等研究中。微卫星DNA的长度一般为100～300bp之间，PCR扩增时，其对样本的质量要求不高，部分降解的基因组DNA样品也能成功扩增，且对样品的需求量少，可以用非损伤性方法获取的极少量样品，尤其适用于濒危物种的研究。利用微卫星位点的高多态性，高稳定性等特点，以多个位点在一定群体中各等位基因的频率为基础进行亲缘关系鉴定，具有很高的识别率，可以用于鉴别在共同环境下混合家系中某个个体的血缘关系和来源属性，为遗传育种工作带来极大的便利。目前为止，还没有杂交鲷家系的鉴定方法。
技术实现思路
为了选育优良的杂交鲷家系，本专利技术提供了一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，该家系的鉴定成功率达99.99％，本专利技术具有不伤害实验动物、方便快捷、准确率高的特点。技术方案一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，包括如下步骤：(1)剪取真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代尾鳍样品，进行基因组DNA的提取；(2)以步骤(1)中亲本和杂交后代的DNA为模板，采用微卫星标记引物进行多重PCR扩增；(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，电泳图谱用BandScan5.0软件分析，结合PCR产物长度判断等位基因大小，确定个体基因型；(4)根据步骤(3)的分析结果建立杂交鲷及其亲本的基因型数据文件；(5)利用Cervus3.0软件进行家系判别。步骤(1)中，真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代的基因组DNA的提取方法为：1)取鱼鳍组织5～20mg，剪碎后置于1.5mL离心管中，加入400μL组织提取液和10μL蛋白酶K，在振荡器上震荡混匀1min，然后放置在55℃恒温水浴锅中水浴消化2.5h；2)往样品中加入300μLExtsolution和300μLABsolution，混匀后，12000rpm离心5min，取下层水相置于GenClean柱中，8000rpm离心1min后，除去废液；3)往GenClean柱中加入500μL洗脱液，8000rpm离心1min；4)重复步骤3)一次；5)取出GenClean柱，弃去收集管中的废液，将GenClean柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1min，以除去残留洗脱液；6)将GenClean柱放入新的洁净1.5ml离心管中，在柱中央加入50～100μLElutionBuffer，室温或55℃放置2min后，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为基因组DNA，最后置于-20℃保存备用。进一步，步骤(2)中，微卫星标记引物为10组，微卫星标记引物1的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示，标记位点为AS1；微卫星标记引物2的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示，标记位点为AS2；微卫星标记引物3的上游引物序列如SEQIDNO.5所示，下游引物序列如SEQIDNO.6所示，标记位点为AS3；微卫星标记引物4的上游引物序列如SEQIDNO.7所示，下游引物序列如SEQIDNO.8所示，标记位点为AS4；微卫星标记引物5的上游引物序列如SEQIDNO.9所示，下游引物序列如SEQIDNO.10所示，标记位点为AS5；微卫星标记引物6的上游引物序列如SEQIDNO.11所示，下游引物序列如SEQIDNO.12所示，标记位点为AS6；微卫星标记引物7的上游引物序列如SEQIDNO.13所示，下游引物序列如SEQIDNO.14所示，标记位点为AS7；微卫星标记引物8的上游引物序列如SEQIDNO.15所示，下游引物序列如SEQIDNO.16所示，标记位点为AS8；微卫星标记引物9的上游引物序列如SEQIDNO.17所示，下游引物序列如SEQIDNO.18所示，标记位点为AS9；微卫星标记引物1的上游引物序列如SEQIDNO.19所示，下游引物序列如SEQIDNO.20所示，标记位点为AS10。进一步，步骤(2)中，PCR扩增的反应体系(25μL)为：ddH2O17.25μL，10×Buffer2.5μL，dNTP0.5μL，引物2μL，基因组DNA1μL，Mg2+1.5μL，Taq酶0.25μL。进一步，步骤(2)中，PCR扩增的反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性40s、57.8-62.0℃退火40s；72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。进一步，步骤(3)中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳采用的是8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶。本专利技术的有益效果：本专利技术采用微卫星标记技术，在10个微卫星座位上区分杂交用雌雄亲本和后代的基因型，可以准确、便捷地确定杂交鲷后代的家系来源，对其系谱进行明确的记录，针对生产上体现出来的生长快，抗逆性强等优良性状，确定其基因型，在育种过程中，选择优良个体基因型，淘汰不良个体基因型，可更加快速高效地选育出优良的杂交鲷家系，为遗传育种工作带来极大的便利，实现分子标记辅助育种的目标。附图说明图本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)剪取真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代尾鳍样品，进行基因组DNA的提取；(2)以步骤(1)中亲本和杂交后代的DNA为模板，采用微卫星标记引物进行多重PCR扩增；(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，电泳图谱用BandScan5.0软件分析，结合PCR产物长度判断等位基因大小，确定个体基因型；(4)根据步骤(3)的分析结果建立杂交鲷及其亲本的基因型数据文件；(5)利用Cervus3.0软件进行家系判别。

【技术特征摘要】
1.一种利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)剪取真鲷雌鱼和黑鲷雄鱼亲本及其杂交后代尾鳍样品，进行基因组DNA的提取；(2)以步骤(1)中亲本和杂交后代的DNA为模板，采用微卫星标记引物进行多重PCR扩增；(3)对步骤(2)的PCR扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色，电泳图谱用BandScan5.0软件分析，结合PCR产物长度判断等位基因大小，确定个体基因型；(4)根据步骤(3)的分析结果建立杂交鲷及其亲本的基因型数据文件；(5)利用Cervus3.0软件进行家系判别。2.如权利要求1所述利用微卫星标记鉴定杂交鲷家系的方法，其特征在于，所述微卫星标记引物有10组，微卫星标记引物1的上游引物序列如SEQIDNO.1所示，下游引物序列如SEQIDNO.2所示，标记位点为AS1；微卫星标记引物2的上游引物序列如SEQIDNO.3所示，下游引物序列如SEQIDNO.4所示，标记位点为AS2；微卫星标记引物3的上游引物序列如SEQIDNO.5所示，下游引物序列如SEQIDNO.6所示，标记位点为AS3；微卫星标记引物4的上游引物序列如SEQIDNO.7所示，下游引物序列如SEQIDNO.8所示，标记位点为AS4；微卫星标记引物5的上游引物序列如SEQIDNO.9所示，下游引物序列如SEQIDNO.10所示，标记位点为AS5；微卫星标记引物6的上游引物序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：张志伟，张志勇，贾超峰，祝斐，孟乾，曹广勇，陈自强，曾海峰，
申请(专利权)人：江苏省海洋水产研究所，
类型：发明
国别省市：江苏,32