一种环介导等温扩增引物及鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法技术

本发明专利技术公开了一种环介导等温扩增引物及鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法，该引物包括cyt b‑4‑F3、cyt b‑4‑B3、cyt b‑4‑FIP和cyt b‑4‑BIP，其序列依次如SEQ.ID.NO.1‑SEQ.ID.NO.4所示；鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法包括以下步骤：提取中药材的基因组DNA作为模板，加入权利要求1所述的引物，65℃温育40min进行LAMP反应，反应结束后，加入核酸染料，日光灯和紫外灯下肉眼观察扩增产物的颜色变化；如若扩增成功则显示绿色，扩增失败，则显示橙色；扩增成功的即为乌梢蛇正品。本方法操作简单、易于掌握、准确性高，可在1小时左右完成鉴别过程。

A Ring-mediated Isothermal Amplification Primer and a Method for Identifying the Truth and False of Chinese Medicine Zaocys dhumnades

The invention discloses a RING-mediated isothermal amplification primer and a method for identifying the authenticity of Chinese medicine Zaocys dhumnades. The primer includes cyt b_4_F3, cyt b_4_B3, cyt b_4_FIP and Cyt b_4_BIP, whose sequence is shown in sequence as SEQ.ID.NO.1_SEQ.ID.NO.4. The method for identifying the authenticity of Chinese medicine Zaocys includes the following steps: extracting the genome of Chinese medicine and adding DNA template The primers mentioned in claim 1 were incubated at 65 ~C for 40 minutes for LAMP reaction. After the reaction, nucleic acid dyes were added, and the color changes of the amplified products were observed by naked eyes under fluorescent and ultraviolet lamps. If the amplification was successful, the products would be green, and if the amplification failed, the products would be orange; if the amplification was successful, the products would be genuine. This method is simple to operate, easy to master, and has high accuracy. It can complete the identification process in about one hour.

【技术实现步骤摘要】
一种环介导等温扩增引物及鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法
本专利技术属于中药材的鉴定鉴别领域，具体涉及分子鉴定，特别涉及一种环介导等温扩增引物及鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法。
技术介绍
根据市场走访及文献调研可知，中药材乌梢蛇的伪品有灰鼠蛇(Ptyaskorros)、赤链蛇(Dinodonrufozonatum)、水蛇(Hurriarhynchops)、印度眼镜蛇(Najanaja)、孟加拉眼镜蛇(Najakaouthia)、闪鳞蛇(Xenopeltisunicolor)、渔游蛇(Xenochrophispiscator)、银环蛇(Bungarusmulticinctus)、马来环蛇(Bungaruscandidus)、蕲蛇(Agkistrodonacutus)等。目前的鉴别技术中，《中国药典》2015版主要采用性状特征和显微特征进行鉴别，依据为：表面黑褐色或绿黑色，密度菱形鳞片：背鳞行数成双，背中央2-4行鳞片强烈起棱，形成两条纵贯全体的黑线。头盘在中间，扁圆形，眼大而下凹陷，有光泽。上唇鳞8枚，第4、5枚入眶，颊鳞1枚，眼前下鳞1枚，较小，眼后鳞2枚。脊部高耸成屋脊状。腹部剖开边缘向内卷曲，脊肌肉厚，黄白色或淡棕色，可见排列整齐的肋骨。尾部渐细而长，尾下鳞双行。剥皮者仅留头尾之皮鳞，中段较光滑。气腥，味淡。角质鳞片近无色或淡黄色，表面具纵向条纹。表皮表面观密布棕色或棕黑色色素颗粒，常连成网状、分枝状或聚集成团。横纹肌纤维淡黄色或近无色。有明暗相间的细密横纹。骨碎片近无色或淡灰色，呈不规则碎块，骨陷窝长梭形，大多同方向排列，骨小管密而较粗。这些鉴别要领要求鉴别者具备相当丰富的鉴别经验，否则不能有效地用于乌梢蛇和混伪品间的鉴别。唐晓晶等2007年在《中国药学杂志》曾报道利用线粒体中的12srRNA基因序列，设计1对引物(HWL-1和HWH-1)，用于鉴别乌梢蛇及其他常见混淆品。但因整个鉴别过程操作时间较长，对乌梢蛇的快速鉴别存在一定的局限性，所以在药材鉴别中的适用性有所受限。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于针对乌梢蛇的保守基因cytb，设计提供一组环介导等温扩增(LAMP)引物。本专利技术的另一目的在于提供一种快速鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法(LAMP法)。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一组环介导等温扩增引物，是cytb-4-F3、cytb-4-B3、cytb-4-FIP和cytb-4-BIP，其序列依次如SEQ.ID.NO.1-SEQ.ID.NO.4所示。该组引物针对乌梢蛇的cytb基因而设计，cytb基因全长为307bp，引物cytb-4-F3长度为18bp，位于该基因的25～42位点；引物cytb-4-B3长度为23b，位于该基因的194～216位点；引物cytb-4-FIP长度为39b，位于该基因的83～103和43～60位点；引物cytb-4-BIP长度为43bp，位于该基因的118～142和176～193位点。一种快速鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法，包括以下步骤：提取中药材的基因组DNA作为模板，加入上述的引物，65℃温育40min进行LAMP反应，反应结束后，加入核酸染料，日光灯和紫外灯下肉眼观察扩增产物的颜色变化；如若扩增成功则显示绿色，扩增失败，则显示橙色；扩增成功的即为乌梢蛇正品；所述的中药材包括乌梢蛇正品及其混伪品；所述的混伪品是灰鼠蛇、赤链蛇、水蛇、印度眼镜蛇、孟加拉眼镜蛇、闪鳞蛇、渔游蛇、银环蛇、马来环蛇或蕲蛇中的一种以上；所述提取中药材的基因组DNA，是使用动物基因组DNA提取试剂盒DNAMiniKit(QIAGENcompany，Germany)，选取无霉变和虫蛀的药材样品30mg，用消毒过的剪刀剪成碎块，置于2mL离心管中；加入180μLBufferATL和20μLproteinaseK，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解；短暂离心，以去除离心管盖内沿液体；加入200μLBufferAL，振荡15s，70℃水浴10min，短暂离心；加入200μL无水乙醇，振荡15s，短暂离心；将以上所得混合液小心加入到离心柱中，将离心柱放入2mL收集管中，以6000×g离心1min，将离心柱取出，放入一支洁净的2mL收集管中；加入500μLBufferAW1到离心柱中，以6000×g离心1min，将离心管取出，放入一支洁净的2mL收集管中；加入500μLBufferAW2到离心柱中，以20000×g离心3min，将离心管取出，放入一支洁净的2mL收集管中；加入50μLBufferAE，室温下静置1min，6000×g离心1min，将收集管盖好，-20℃备用；所述的LAMP反应，反应体系为：共25μL，含BstDNA聚合酶(800U)1μL，10×TherrmoPolReactionBuffer2.5μL，MgSO4(100mM)1.5μL，dNTPs(10mM)3.5μL，外引物FIP(10μM)4μL，外引物BIP(10μM)4μL，内引物F3(10μM)0.5μL，内引物B3(10μM)0.5μL，DNA模板(60～82ng/μL)1μL，无菌水补足至25μL。所述的核酸染料优选SYBRGreenI。本专利技术相对于现有聚合酶链式反应法(PCR)具有如下的优点及效果：(1)特异性强，准确率高。PCR技术需要2条引物，而LAMP技术针对靶基因的6个区域，设计得到4条引物，特异性和准确度有所提高。(2)反应快速，高效。LAMP技术在15～40min可扩增出大量的目的核酸片段，1小时内可完成整个鉴定过程。(3)操作简单，价格低廉。LAMP技术不需要PCR循环扩增仪，仅需用到常用水浴锅或加热装置即可完成扩增反应，扩增产物不需要进行凝胶电泳，实验操作步骤减少，实验成本缩减。附图说明图1是乌梢蛇及混伪品基因组DNA电泳图；图2是乌梢蛇与其他10种混伪品的LAMP反应产物在日光灯下的颜色；图3是乌梢蛇与其他10种混伪品的LAMP反应产物在紫外灯下的颜色；其中，1乌梢蛇，2印度眼镜蛇，3马来环蛇，4蕲蛇，5赤链蛇，6灰鼠蛇，7银环蛇，8闪鳞蛇，9孟加拉眼镜蛇，10渔游蛇，11水蛇，N阴性对照；M：DNAladder最亮的条带为500bp，向下依次为400bp、300bp、200bp、100bp。具体实施方式下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例一种快速鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法，包括以下步骤：(1)提取基因组DNA：选取无霉变和虫蛀的药材样品约30mg，用消毒过的剪刀剪成碎块，置于2mL离心管中。加入180μLBufferATL和20μLproteinaseK，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解。短暂离心，以去除离心管盖内沿液体。加入200μLBufferAL，振荡15s，70℃水浴10min，短暂离心。加入200μL无水乙醇，振荡15s，短暂离心。将以上所得混合液小心加入到离心柱中，将离心柱放入2mL收集管中，以6000×g离心1min，将离心柱取出，放入一支洁净的2mL收集管中。加入500μLBufferAW1到离心柱中，以6000×g离心1min，将离心管取出，放入一支洁净的2mL收集管中。加入500μLBufferAW2到离心柱中，以2000本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组环介导等温扩增引物，其特征在于：是cyt b‑4‑F3、cyt b‑4‑B3、cyt b‑4‑FIP和cyt b‑4‑BIP，其序列依次如SEQ.ID.NO.1‑SEQ.ID.NO.4所示。

【技术特征摘要】
1.一组环介导等温扩增引物，其特征在于：是cytb-4-F3、cytb-4-B3、cytb-4-FIP和cytb-4-BIP，其序列依次如SEQ.ID.NO.1-SEQ.ID.NO.4所示。2.一种快速鉴别中药材乌梢蛇真伪的方法，其特征在于包括以下步骤：提取中药材的基因组DNA作为模板，加入权利要求1所述的引物，65℃温育40min进行LAMP反应，反应结束后，加入核酸染料，日光灯和紫外灯下肉眼观察扩增产物的颜色变化；如若扩增成功则显示绿色，扩增失败，则显示橙色；扩增成功的即为乌梢蛇正品。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述的中药材包括乌梢蛇正品及其混伪品。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的混伪品是灰鼠蛇、赤链蛇、水蛇、印度眼镜蛇、孟加拉眼镜蛇、闪鳞蛇、渔游蛇、银环蛇、马来环蛇或蕲蛇中的一种以上。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述提取中药材的基因组DNA，是使用动物基因组DNA提取试剂盒DNAMiniKit，选取无霉变和虫蛀的药材样品30mg，用消毒过的剪刀剪成碎块，置于2mL离心管中；加入180μLBufferATL和20μLproteinaseK，振荡处理20s，56℃水浴至组织完全裂解；短暂离心，以去除离心管盖内沿液体；加入200μLBuf...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹晖，周娜娜，张英，吴孟华，何倾，马志国，
申请(专利权)人：暨南大学，
类型：发明
国别省市：广东,44