一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记技术方案

本发明专利技术公开了一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，包括，1)利用EPIC基因序列全长设计通用引物，对石首鱼科不同属代表种进行扩增，对扩增产物进行测序；2)利用线粒体COI基因对不同属代表种进行扩增，对扩增产物进行测序；3)对步骤1和步骤2的扩增产物进行比对，计算石首鱼科不同属代表种的序列变异、碱基组成及遗传距离，判断石首科鱼类的系统发育关系。有益效果为：本发明专利技术分子标记利用核基因DNA序列，同时结合线粒体COI基因，对我国常见石首科鱼类做进一步的系统发育关系的梳理和确定，操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好。

An EPIC Molecular Marker for Phylogenetic Analysis of Sciaenidae Fishes

The present invention discloses an EPIC molecular marker for phylogenetic analysis of Sciaenidae fishes, which includes: (1) using full-length EPIC gene sequence to design universal primers to amplify representative species of different genera of Sciaenidae and to sequence the amplified products; (2) amplifying representative species of different genera by mitochondrial COI gene, and sequencing the amplified products; (3) amplifying step 1 and step 2; By comparing the products, we calculated the sequence variation, base composition and genetic distance of representative species of different genera of Sciaceae, and judged the phylogenetic relationship of Sciaceae. The beneficial effects are as follows: the molecular markers of the present invention utilize nuclear gene DNA sequence and mitochondrial COI gene to further sort out and determine the phylogenetic relationship of common Stonecropoda fishes in China. The method has the advantages of simple operation, high resolution, abundant genetic markers, high universal primers, low price, high accuracy and good technical reproducibility.

【技术实现步骤摘要】
一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记
本专利技术涉及分子标记
，尤其是涉及一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记。技术背景Exon-primedintron-crossing(EPIC)是指由基因的外显子DNA序列作为引物，通过PCR扩增、测序等来检测内含子的多态性，与传统的分子标记相比，EPIC是一种新型的遗传标记，具有一些不同的特点。由于内含子比较保守，因此利用EPIC设计引物时，选取其中最为保守的序列，这在种间、甚至属间，都具有较好的通用性。另外，EPIC内含子标记不容易引起由引物结合位点的缺失、插入或突变而导致PCR扩增出现问题，因此，相对于微卫星分子标记，等位基因扩增丢失和无效等位基因的概率较低。EPIC标记的开发得到推广来并已经应用到不同的鱼类的研究中，但是在开发EPIC标记时，值得注意的是，作为标记的内含子序列，长度一定要适合，如果内含子序列过长，可能导致PCR无法成功扩増，失去多态性分析的意义。另外，只有该物种或亲缘关系巧近的物种的全基因组序列和cDNA序列具备的情况下，才能找到EPIC序列的外显子与内含子界限，送一条件某种程度上限制了研究材料，而没有分子生物学研究背景的材料更难于进行。最后，在利用EPIC标记进行遗传分析时，该物种基因組内基因复制及其造成的影响也是需要考虑的。石首鱼科(Sciaenidae)隶属鲈形目，在全世界范围内共有70个属300余种，是鲈形目中属种最多的科之一。我国沿海石首鱼类种属众多，共有17个属30多种。石首鱼科的绝大多数种类肉味鲜美、经济价值高，是海洋渔业和海水养殖的重要对象。石首科鱼类是我国海洋经济鱼类中产量最大的类群之一，是中国重要的海洋经济鱼类。石首鱼的系统发育关系仍纷繁复杂，有待于用更多的分子手段、方法来进一步理顺及验证。而利用核基因序列内含子多态性(EPIC)序列全长设计通用引物，对石首鱼科不同属代表种进行扩增，对扩增产物进行测序并对各序列进行一系列生物学信息分析，同时对序列进行了同源性比对分析和系统进化树的构建；初步确定了该内含子在石首科鱼类的标记作用，并根据这种研究结果将为石首科鱼类的种质资源保护提供一定的理论基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好的用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记。本专利技术针对
技术介绍
中提到的问题，采取的技术方案为：一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。本专利技术EPIC分子标记具有操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好的优势，利用EPIC，从一个新的角度，利用核基因DNA序列，同时结合线粒体COI基因，对我国常见石首科鱼类做进一步的系统发育关系的梳理和确定，根据扩增出的外显子及内含子序列判断它们的系统发育关系，具有外显子的保守性以及内含子的高进化速度的优点，且核基因由于长度适中、易于扩増、进化速度快、变异性高，在基因组中含有丰富的遗传信息，为探讨石首鱼类分子系统发育关系做进一步尝试。作为优选，线粒体COI基因序列及检测步骤为：1)DNA模板的制备；2)COI基因PCR扩增和测序；PCR扩增用引物为：F1：5’-TCATCCAACGACAAACGAATTGGCAT-3’，R1：5’-TAGACTTGTGGCTTGCCGAATATCA-3’。进一步优选，PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5U/ulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。进一步优选，PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增36个循环；72℃总延伸4min。作为优选，利用EPICDNA序列检测步骤为：1)DNA模板的制备；2)PCR扩增和测序。作为优选，PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5U/ulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。进一步优选，PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增30个循环；72℃总延伸4min。作为优选，PCR扩增反应后用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP。进一步优选，虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的用量比为100:3.4-4.2。该虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝的合理比例能够发挥增益作用，不仅能与虾碱性磷酸酶反应底物中的有机磷或者水解生成的磷酸根络合，避免磷的存在而影响虾碱性磷酸酶的活性，而且还可以与虾碱性磷酸酶中的活性部位结合而提高虾碱性磷酸酶的活性和动力学转化，进而加快虾碱性磷酸酶消化PCR反应体系中剩余的dNTP，能够得到DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，使得EPIC分子标记准确性高、技术重现性好。更进一步优选，消化反应程序为37℃孵育30min，85℃灭活5min。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术EPIC分子标记具有操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好的优势；本专利技术利用虾碱性磷酸酶和二氯烷基铝消化PCR反应体系中剩余的dNTP，能够得到DNA主带单一明亮，无拖尾现象，且不存在蛋白质等杂质所导致的亮带，使得EPIC分子标记准确性高、技术重现性好。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术方案作进一步说明：实施例1：一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。该EPIC分子标记具有操作简单、分辨率高、遗传标记丰富、引物通用性高、价格低廉、准确性高、技术重现性好的优势，利用EPIC，从一个新的角度，利用核基因DNA序列，同时结合线粒体COI基因，对我国常见石首科鱼类做进一步的系统发育关系的梳理和确定，根据扩增出的外显子及内含子序列判断它们的系统发育关系，具有外显子的保守性以及内含子的高进化速度的优点，且核基因由于长度适中、易于扩増、进化速度快、变异性高，在基因组中含有丰富的遗传信息，为探讨石首鱼类分子系统发育关系做进一步尝试。上述线粒体COI基因序列及检测步骤为：1)DNA模板的制备a.取冰冻组织300mg，用小剪刀剪至肌肉组织呈粉末状，并转入2ml的Eppendorf管中，放入电热鼓风干燥箱，50℃干燥10min使组织中酒精完全挥发；b.将EP管取出，加入550ul组织裂解液(EDTA:SDS＝10:1比例预先配好)，然后分别加入30ul蛋白酶K和5ulRNA酶，震荡3min后，转入恒温水浴锅中，55℃裂解5h，期间每隔30min颠倒混匀一次；c.取出EP管，转至超净工作台，冷却至室温，加入500ul平衡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：将EPIC DNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。

【技术特征摘要】
1.一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：将EPICDNA序列检测结合线粒体COI基因序列检测，根据扩增出的外显子及内含子序列判断石首科鱼类的系统发育关系。2.根据权利要求1所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述线粒体COI基因序列及检测步骤为：1)DNA模板的制备；2)COI基因PCR扩增和测序；所述PCR扩增用引物为：F1：5’-TCATCCAACGACAAACGAATTGGCAT-3’，R1：5’-TAGACTTGTGGCTTGCCGAATATCA-3’。3.根据权利要求2所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应步骤中PCR扩增反应体系采用50ul体系，包括1ul20uM上游引物、1ul20uM下游引物、8ul2.5mMdNTP、5ul10×buffer、0.5ul5U/ulTaq酶、2.5ngDNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。4.根据权利要求2所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的EPIC分子标记，其特征在于：所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃退火40s，72℃延伸70s，扩增36个循环；72℃总延伸4min。5.根据权利要求1所述的一种用于石首鱼科鱼类系统发育分析的...

【专利技术属性】
技术研发人员：江丽华，龚理，刘炳舰，吕振明，刘立芹，
申请(专利权)人：浙江海洋大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33