用于检测微生物的新颖组合物、方法和试剂盒技术

用于检测微生物和/或分析微生物群的方法、组合物和试剂盒，例如通过使用核酸扩增和检测。

Novel compositions, methods and kits for the detection of microorganisms

Methods, compositions and kits for the detection and/or analysis of microorganisms, such as amplification and detection by using nucleic acids.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测微生物的新颖组合物、方法和试剂盒相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2016年6月16日提交的美国临时申请62/351,226和2016年6月17日提交的美国临时申请62/351,843的权益。上述申请的全部内容通过引用的方式并入本文中。
本公开一般涉及分子生物学和遗传分析领域，具体涉及核酸试剂和用于扩增、检测和/或分析引起感染的微生物和微生物群的相应方法。
技术介绍
多种微生物可引起或促成疾病和病症。感染因子可以从个体传播到个体并导致人群中的疾病。共生存在于宿主上或内的微生物可在个体的微生物群体中出现不平衡时导致宿主疾病。人类微生物组计划为人类和动物微生物组的组成以及维持特定组织平衡的能力提供了丰富的见解。阴道、泌尿生殖道和泌尿道组织是丰富的环境，其中细菌、真菌、病毒和/或寄生微生物的发病率可导致不平衡，从而导致该部位的严重影响。例如，阴道菌群的不平衡与阴道感染有关，阴道感染与早产、不育和性传播疾病的风险增加有关。目前用于阴道和尿微生物菌群监测和检测的技术成本高，缺乏灵敏度和/或特异性，和/或需要复杂或冗长的工作流程。需要用于评估和监测用于监测和分析阴道、泌尿生殖道和泌尿道感染和微生物群的敏感、特异、高效和成本有效的系统的方法和系统。
技术实现思路
本文提供了用于扩增核酸样品中的多个核酸序列的方法、组合物和试剂盒，其包括：平行进行多个扩增反应，至少一个扩增反应含有一部分核酸样品和配置用于产生对应于靶核酸序列的扩增产物(例如扩增子)的一对扩增引物；形成多种不同的扩增产物；并确定至少一种扩增产物的存在与否。在一些实施方案中，扩增子包含表4中列出的序列(即SEQIDNO：1至34)。在一些实施方案中，靶核酸序列含有与表1中列出的微生物的核酸序列相同或互补的核酸序列。在一些实施方案中，靶核酸序列含有表2中列出的基因的核酸序列的一部分或其相应的cDNA。另一方面，本文提供了用于检测样品中微生物核酸的存在的方法、组合物和试剂盒，该方法包括：将核酸样品的部分分配到位于载体内的各个反应室；在各个反应室中进行平行扩增反应和形成扩增产物，其中每个扩增反应包含一对扩增引物，其配置成产生对应于存在于微生物的基因组中或衍生自微生物的基因组的靶核酸序列的扩增产物(例如扩增子)，并确定是否已在一个或多个单独的反应室中形成扩增产物。在一些实施方案中，扩增子包含表4中列出的序列(即SEQIDNO：1至34)。在一些实施方案中，靶核酸序列含有与表1中列出的微生物的核酸序列相同或互补的核酸序列。在一些实施方案中，靶核酸序列含有表2中列出的基因的核酸序列的一部分或其相应的cDNA。另一方面，本文提供了用于核酸扩增的支撑物，其包含：载体，其包含位于载体内或载体表面上的多个反应位点；至少一个反应位点含有：(i)扩增引物对，其配置为扩增相应的靶核酸序列以产生扩增产物(例如扩增子)，和(ii)可检测标记的探针，其配置为与通过延伸该对扩增引物的至少一个产生的核酸序列杂交。在一些实施方案中，扩增子包含表4中列出的序列(即SEQIDNO：1至34)。在一些实施方案中，靶核酸序列含有与表1中列出的微生物的核酸序列相同或互补的核酸序列。在一些实施方案中，靶核酸序列含有表2中列出的基因的核酸序列的一部分或其相应的cDNA。另一方面，本文提供了用于体外扩增和检测来自表1中列出的至少一种微生物的样品中的至少一种靶的方法、组合物和试剂盒，其包含：(a)使样品与至少一个扩增引物对接触，其中每个引物包含靶杂交区，其配置为产生对应于所述至少一个靶核酸序列的扩增子；(b)在适于使用所述引物对产生对应于至少一种靶核酸序列的扩增子的条件下进行至少一次体外扩增反应，其中扩增子包含表4中列出的序列(即SEQIDNO：1至34)；(c)检测步骤(b)中产生的扩增子，其中检测包括使扩增子与检测探针接触，所述检测探针配置成与扩增子区域的全部或部分特异性杂交。在一些实施方案中，此类方法用于体外扩增和检测样品中的多个(例如2、3、4、5、6、7个等)不同靶标，例如来自表1中列出的多个(例如2、3、4、5、6、7个等)不同微生物的靶标。在一些实施方案中，所述方法产生长度为50至300个核苷酸的扩增子。在一些实施方案中，扩增引物对和检测探针是选自表3的测定的组分。另一方面，本文提供了用于确定生物样品中表1中列出的一种或多种微生物存在或不存在至少一种靶核酸的方法、组合物和试剂盒，该组合物包含：(a)至少一个扩增引物对，其中所述对的引物的每个包含靶杂交区，其被配置为与靶核酸的全部或部分区域特异性杂交，并且其中在合适的条件下，引物对产生包含表4中列出的序列(即SEQIDNO：1至34)的扩增子；和(b)至少一种检测探针，其配置成与引物对产生的扩增子的全部或部分区域特异性杂交。在一些实施方案中，扩增子的长度为50至300个核苷酸。在一些实施方案中，至少一个扩增引物对和至少一个检测探针是选自表3的测定的组分。在其他方面，本文提供了一组用于检测一组生物标记的核苷酸探针，该探针与一组基因的DNA和/或RNA序列互补；其特征在于，所述基因组选自表2中列出的那些的任何组合。在一些实施方案中，该组核苷酸探针选自表3中列出的测定的任何组合。在一些实施方案中，该组探针包含2至34种不同的探针，其选自表3中列出的不同测定。在其他方面，本文提供了用于分析与生物样品相关的一组生物标记的方法、组合物和试剂盒，其包括：(a)从受试者获得生物样品；(b)使至少一部分样品与多个单独的扩增反应接触，每个单独的反应包括一组靶特异性引物和聚合酶；(c)在能够产生扩增产物的条件下，每个反应扩增至少一个靶序列；(c)使多个单独反应中的每一个与对靶特异性引物产生的扩增产物特异的可检测标记的探针接触；(d)在多个单独的扩增反应的每一个中确定扩增产物的存在或不存在，以得到生物样品的生物标记谱。在一些实施方案中，生物标记与阴道、泌尿生殖道或泌尿道感染和/或微生物群相关。在一些实施方案中，该组包含一组2至34种不同的生物标记。在一些实施方案中，多个单独的扩增反应位于固体载体上。在一些实施方案中，多个单独的扩增反应位于相同载体上。在一些实施方案中，每个单独的扩增反应包含至少一种选自表3的测定。在一些其他方面，本文提供了用于在人受试者中分析基因表达的方法、组合物和试剂盒，该方法包括为一组基因的每个基因确定在受试者的生物样品中由该基因编码的RNA水平，其中所述组包含鉴定为表3中列出的基因或其任何组合的基因。在一些实施方案中，方法包括使用选自表3中列出的那些的一组测定扩增和检测该组基因。在一些实施方案中，基因组衍生自表1中列出的任何微生物。在一些实施方案中，该方法包括产生对应于由基因编码的RNA或DNA的至少一种扩增产物，其特征在于扩增产物包含选自表4中列出的那些的序列。在一些实施方案中，基因组包含2至34种不同的基因。本文中提供了本教导的这些和其它特征。附图说明技术人员将理解下面描述的附图仅用于说明目的。附图不旨在以任何方式限制本教导的范围。图1描绘了针对一组十二个不同靶标的测定的检测限和动态范围的图解结果。在每个图中，X轴显示模板浓度的log10，Y轴显示PCRCt值。图2A和图2B描绘了二路普霍沃尔菌(Pre本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种扩增核酸样品中多个核酸序列的方法，包括：(a)进行多个扩增反应，所述扩增反应中的至少一个含有一部分核酸样品和一对扩增引物，所述扩增引物配置成产生对应于所述靶核酸序列的扩增产物，其中所述扩增产物包含表4中列出的序列(即SEQ ID NO：1至34)；(b)形成多种不同扩增产物；和(c)确定所述多种不同扩增产物中至少一种的存在或不存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.06.16 US 62/351,226;2016.06.17 US 62/351,8431.一种扩增核酸样品中多个核酸序列的方法，包括：(a)进行多个扩增反应，所述扩增反应中的至少一个含有一部分核酸样品和一对扩增引物，所述扩增引物配置成产生对应于所述靶核酸序列的扩增产物，其中所述扩增产物包含表4中列出的序列(即SEQIDNO：1至34)；(b)形成多种不同扩增产物；和(c)确定所述多种不同扩增产物中至少一种的存在或不存在。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述扩增产物的长度为50-300个核苷酸。3.根据权利要求1所述的方法，其中配置成产生扩增产物的至少一对所述扩增引物包括含有与所述相应靶核酸序列的一部分互补或相同的核酸序列的引物。4.根据权利要求1所述的方法，其中至少一对所述扩增引物的所述相应靶核酸序列含有与基因组DNA、RNA、miRNA、mRNA、无细胞DNA、循环DNA或cDNA中存在的核酸序列相同或互补的核酸序列。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述相应靶核酸序列存在于靶微生物的基因组DNA、RNA、miRNA、mRNA、无细胞DNA、循环DNA或cDNA中或衍生自它们。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述靶微生物是表1中列出的微生物。7.根据权利要求5所述的方法，其中所述靶微生物是二路普霍沃尔菌。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述形成包括并行形成10至10,000种不同的扩增产物。9.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个扩增反应中的至少两个各自包含被配置为扩增不同的相应靶核酸序列的一对扩增引物。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述相应靶核酸序列含有表2中列出的基因的核酸序列的一部分或其相应的cDNA。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基因存在于表1中列出的微生物中。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个扩增反应中的每一个含有被配置为扩增表2中列出的基因的至少一部分的一组扩增引物。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个扩增反应中的每一个含有配置成产生50-300个核苷酸长的扩增产物的一组扩增引物。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述形成包括形成含有与表2中列出的基因的一部分互补或相同的核酸序列的一种或多种扩增产物。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述形成包括使用衍生自表1中列出的微生物的核酸样品形成表2中列出的所有基因的单独的扩增产物。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述形成包括形成表3中列出的所有微生物基因的单独的扩增产物。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述形成包括形成表3中列出的微生物基因的至少两种的任何组合的单独的扩增产物。18.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个扩增反应中的一个或多个还含有可检测标记的探针，其包括与所述相应靶核酸序列的一部分相同或互补的序列。19.根据权利要求18所述的方法，其中至少一种扩增反应的所述可检测标记的探针被配置为在5′核酸酶测定中通过聚合酶进行切割。20.根据权利要求18所述的方法，其中至少一种扩增反应的所述可检测标记的探针在其5′末端含有荧光标记，在其3′末端含有猝灭剂。21.根据权利要求18所述的方法，其中所述可检测标记的探针还含有小沟结合物(MGB)部分。22.根据权利要求1所述的方法，其中至少一个所述扩增反应在载体内或载体上存在的单独的反应位点发生，所述载体含有一个或多个单独的反应位点。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述载体选自多孔板、微流体卡和包含多个通孔反应位点的板。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述单独的反应位点包括一种或多种所述扩增引物，并且所述扩增还包括将一部分所述核酸样品分配到所述单独的反应位点。25.根据权利要求22所述的方法，其中所述单独的反应位点包括含有一对扩增引物和核酸探针的溶液的干燥沉积物，其中所述引物和探针均配置为扩增源自表2中列出的基因的核酸序列。26.根据权利要求24所述的方法，其中所述单独的反应位点在所述核酸样品的所述部分分配到所述反应位点之前或之后进一步包括聚合酶和核苷酸。27.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸样品由阴道拭子样品制备。28.根据权利要求1所述的方法，包括在进行所述多个扩增反应之前从阴道拭子样品制备所述核酸样品。29.一种检测样品中微生物核酸存在的方法，所述方法包括：(a)将核酸样品的部分分配到位于载体内的各个反应室中；(b)在各个反应室中进行平行扩增反应和形成扩增产物，其中每个扩增反应包含一对扩增引物，其配置成产生对应于存在于微生物的基因组内或源自微生物的基因组的所述靶核酸序列的扩增产物，其中所述扩增产物包含表4中列出的序列(即SEQIDNO：1至34)；和(c)确定所述扩增产物是否已在一个或多个所述各个反应室中形成。30.根据权利要求28所述的方法，其中所述扩增产物的长度为50-300个核苷酸。31.根据权利要求29所述的方法，其中所述确定包括检测可检测标记的探针与所述扩增产物的杂交，任选地实时进行。32.根据权利要求29所述的方法，其中配置成产生对应于所述靶核酸序列的扩增产物的至少一对所述扩增引物包括含有与所述相应靶核酸序列的一部分互补或相同的核酸序列的引物。33.根据权利要求26所述的方法，其中至少一对所述扩增引物的所述相应靶核酸序列含有与基因组DNA、RNA、miRNA、mRNA、无细胞DNA、循环DNA或cDNA中存在的核酸序列相同或互补的核酸序列。34.根据权利要求33所述的方法，其中所述相应靶核酸序列存在于靶微生物的基因组DNA、RNA、miRNA、mRNA、无细胞DNA、循环DNA或cDNA中或衍生自它们。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述微生物是表1中列出的微生物。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述微生物是二路普霍沃尔菌。37.根据权利要求29所述的方法，其中所述形成包括并行形成10至10,000种不同的扩增产物。38.根据权利要求29所述的方法，其中所述扩增反应中的至少两个各自包含被配置为扩增不同的相应靶核酸序列的一对扩增引物。39.根据权利要求29所述的方法，其中所述相应靶核酸序列含有表2中列出的基因的核酸序列的一部分或其相应的cDNA。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述基因存在于表1中列出的微生物中。41.根据权利要求29所述的方法，其中所述扩增反应中的每一个含有被配置为扩增表2中列出的基因的至少一部分的扩增引物。42.根据权利要求29所述的方法，其中所述形成包括形成含有与表2中列出的基因的一部分互补或相同的核酸序列的一种或多种扩增产物。43.根据权利要求29所述的方法，其中所述多个扩增反应中的每一个含有配置成产生50-300个核苷酸长的扩增产物的一组扩增引物。44.根据权利要求42所述的方法，其中所述形成包括使用衍生自表1中列出的微生物的核酸样品形成表2中列出的所有基因的单独的扩增产物。45.根据权利要求42所述的方法，其中所述形成包括形成表3中列出的所有微生物基因的单独的扩增产物。46.根据权利要求42所述的方法，其中所述形成包括形成表3中列出的微生物基因的至少两种的任何组合的单独的扩增产物。47.根据权利要求26所述的方法，其中所述多个所述扩增反应中的一个或多个还含有可检测标记的探针，其包括与所述相应靶核酸序列的一部分相同或互补的序列。48.根据权利要求47所述的方法，其中至少一种扩增反应的所述可检测标记的探针被配置为在5′核酸酶测定中通过聚合酶进行切割。49.根据权利要求47所述的方法，其中至少一种扩增反应的所述可检测标记的探针在其5′末端含有荧光标记，在其3′末端含有猝灭剂。50.根据权利要求47所述的方法，其中所述可检测标记的探针还含有小沟结合物(MGB)部分。51.根据权利要求29所述的方法，其中至少一个所述扩增反应在载体内或载体上存在的单独的反应位点发生，所述载体含有一个或多个单独的反应位点。52.根据权利要求51所述的方法，其中所述载体选自多孔板、微流体卡和包含多个通孔反应位点的板。53.根据权利要求51所述的方法，其中所述单独的反应位点包括一种或多种所述扩增引物，并且所述扩增还包括将一部分所述核酸样品分配到所述单独的反应位点。54.根据权利要求29所述的方法，其中所述各个反应室包括含有一对扩增引物和核酸探针的溶液的干燥沉积物，其中所述引物和探针均配置为扩增源自表2中列出的基因的核酸序列。55.根据权利要求54所述的方法，其中所述各个反应室在所述核酸样品的所述部分分配到所述反应位点之前或之后进一步包括聚合酶和核苷酸。56.根据权利要求29所述的方法，其中所述核酸样品由阴道拭子样品制备。57.根据权利要求29所述的方法，包括在所述分配之前从阴道拭子样品制备所述核酸样品。58.一种用于核酸扩增的支撑物，包括：载体，其包含位于所述载体内或所述载体表面...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·帕加尼，P·布尔佐斯卡，李柯，S·帕特尔，黄波立，K·瓦尔玛，N普瑞，E·戴尔蒙德，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US