转录因子MyoD在调控猪RTL1基因表达中的应用制造技术

本发明专利技术提供了转录因子MyoD在调控猪RTL1基因表达中的应用。以RTL1为研究对象，通过构建猪RTL1基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒，并找到RTL1的核心启动子区；再验证转录因子MyoD与RTL1核心启动子区之间的相互作用；随后构建MyoD超表达载体和合成小干扰RNA，检测MyoD对RTL1的影响；还构建了转录因子MyoD结合位点突变型荧光表达载体MyoD‑mut转染PK15和C2C12细胞后检测荧光素酶活性。本发明专利技术首次证实转录因子MyoD对RTL1基因转录调控的影响，为RTL1的表达调控带来了更深层次的认知，运用于家畜肉质性状的改良及肌肉发育分子调控机制的研究具有较好的应用前景。

Application of transcription factor MyoD in regulation of RTL1 gene expression in pigs

The present invention provides the application of transcription factor MyoD in regulating pig RTL1 gene expression. Taking RTL1 as the research object, we constructed the recombinant plasmid of double luciferase reporter gene of pig RTL1 gene promoter, and found the core promoter region of RTL1. Then we verified the interaction between transcription factor MyoD and RTL1 core promoter, then constructed MyoD super expression vector and synthetic small interfering RNA to detect the effect of MyoD on RTL1, and constructed a transcription factor MyoD binding site mutant fluorin. Luciferase activity was detected after transfection of PK15 and C2C12 cells with light expression vector MyoD mut. The invention for the first time confirms the effect of transcription factor MyoD on the transcription regulation of RTL1 gene, brings a deeper understanding for the expression regulation of RTL1, and has a good application prospect in improving meat quality traits of livestock and studying the molecular regulation mechanism of muscle development.

【技术实现步骤摘要】
转录因子MyoD在调控猪RTL1基因表达中的应用
本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及转录因子MyoD在调控猪RTL1基因表达中的应用。
技术介绍
RTL1基因(反转录转座子1基因，retrotransposon-like-1)，又名父本表达基因11(paternallyexpressedgene11,Peg11),在人和小鼠中为父本表达的印记基因，没有内含子序列。RTL1基因在胚胎和胎盘组织中表达量很高，对母体胎盘与胎儿的营养传递起着重要作用，敲除该基因的小鼠表现为胎儿死亡率升高、新生儿生长停滞、胎盘尺寸偏小；与人的胎儿发育和新生儿的生长也有密切关系。该基因位于DLK1-DIO3印记区域，此区域基因对肌肉发育有一定的影响，在转基因小鼠中异位表达RTL1基因，会导致肌肉肥大；此外，该基因与callipyge绵羊的肌肉肥大相关，双肌臀的绵羊中RTL1基因的表达量是正常绵羊中的12倍。基因表达调控研究是当前分子生物学研究的热点之一，而转录水平的调控是基因表达过程中最重要的第一步，转录因子是能与基因特定序列专一性结合，从而调节目的基因表达的蛋白质分子。转录因子在转录调控过程中直接或间接地识别和结合在顺式作用元件的核心序列上，参与调控靶基因的转录。因此筛选与鉴定基因的转录因子成为研究基因表达调控最为重要的一步，并为研究基因表达调控奠定基础。而有关RTL1基因的调控方面未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术之缺陷，提供了转录因子MyoD在调控猪RTL1基因表达中的应用，首次证实转录因子MyoD对RTL1基因转录调控的影响：通过双荧光素酶报告系统找到RTL1基因的核心启动子区，进而利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)验证转录因子MyoD与RTL1核心启动子区之间的相互作用、构建MyoD超表达载体和合成小干扰RNA(MyoD-siRNA)检测MyoD对RTL1的影响、以及构建了转录因子MyoD结合位点突变型荧光表达载体MyoD-mut转染PK15细胞和C2C12细胞后检测荧光素酶活性。为实现上述目的，本专利技术是这样实现的：本专利技术的目的之一在于提供了转录因子MyoD在调控猪RTL1基因表达中的应用。转录因子MyoD对RTL1基因的启动子活性具有抑制作用，从而下调RTL1基因的表达。本专利技术的目的之二在于提供了抑制转录因子MyoD表达的siRNA，其特征在于，其为以下三条siRNA中的至少一种：siRNA1，其正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；siRNA2，其正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；siRNA3，其正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。优选地，所述siRNA为siRNA2。具体地，所述siRNA1、siRNA2、siRNA3序列的3’端均垂悬有dTdT。本专利技术的目的之三在于提供了所述的抑制转录因子MyoD表达的siRNA在促进猪RTL1基因表达中的应用。本专利技术的目的之四在于提供了转录因子MyoD与RTL1基因的结合位点突变型载体，该载体包含如SEQIDNO.7所示的核苷酸序列。本专利技术的目的之五在于提供了转录因子MyoD的超表达载体，所述超表达载体上包含转录因子MyoD的CDS区域。具体地，将MyoD的CDS区域连入pcDNA3.1真核表达载体中，构建转录因子超表达载体pc-MyoD。本专利技术的目的之六在于提供了所述的超表达载体在抑制猪RTL1基因表达中的应用。本专利技术具有的有益效果是：1、在研究猪RTL1基因的调控机制上，本专利技术人发现了转录因子MyoD能够与RTL1基因上游的启动子区相互作用从而下调RTL1基因的表达。本专利技术是首次证实转录因子MyoD对RTL1基因转录调控的影响：通过双荧光素酶报告系统找到RTL1基因的核心启动子区，进而利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)验证转录因子MyoD与RTL1核心启动子区之间的相互作用、构建MyoD超表达载体和合成小干扰RNA(MyoD-siRNA)检测MyoD对RTL1的影响、以及构建了转录因子MyoD结合位点突变型荧光表达载体MyoD-mut转染PK15细胞和C2C12细胞后检测荧光素酶活性。为RTL1的表达调控带来了更深层次的认知，运用于家畜肉质性状的改良及肌肉发育分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。2、本专利技术技术方案设计周详，结果可靠。为证实转录因子MyoD对RTL1基因转录调控作用以及细胞功能上的影响，本专利技术从多层次、多角度验证，在转录活性、mRNA水平以及蛋白水平验证。附图说明图1为实施例1中的pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5、和pGL3-Basic分别转染C2C12细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果；图中：纵坐标RelatedLuciferaseActivity表示相对荧光素酶活性值，Basic为空白对照；图2为实施例2中转录因子MyoD与RTL1基因核心启动子结合的染色质免疫共沉淀(ChIP)后的PCR电泳图；图3为实施例3中转录因子MyoD结合位点突变型荧光表达载体MyoD-mut和pGL3-P2野生型载体、以及pGL3Basic分别同时转染PK15细胞和C2C12细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果；图中：纵坐标RelatedLuciferaseActivity表示相对荧光素酶活性值，P2为对照组，**P<0.01；图4为实施例4中pGL3-P2分别与转录因子MyoD的超表达载体pc-MyoD和pcDNA3.1空白对照共转染于PK15细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果；图中：纵坐标RelatedLuciferaseActivity表示相对荧光素酶活性值，pcDNA3.1为空白对照，**P<0.01；图5为实施例4中转录因子MyoD的超表达载体pc-MyoD对RTL1基因表达量的影响；图6为实施例5中转染siRNA后，荧光定量PCR检测对MyoD基因mRNA水平干扰效果图；图7为实施例5中转染siRNA后，荧光定量PCR检测对RTL1基因启动子活性的影响图；图8为实施例5中转染siRNA后，western-blot检测对RTL1基因蛋白水平干扰效果图。具体实施方式实施例1猪RTL1基因的核心启动子区的确定1、猪RTL1基因启动子区的生物学信息分析根据NCBI中猪RTL1基因的序列，设计引物RPF1(如SEQIDNO:9所示)、RPR1(如SEQIDNO:10所示)，克隆获得RTL1基因5’上游序列包括其第一外显子的一部分共1475bp(-1394/+81)的核苷酸序列(如SEQIDNO:8所示)。运用在线网站(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测发现-1027bp到-978bp区段可能是基因的核心启动子区。2、引物设计为了进一步验证，以上述获得的RTL1基因5’上游序列为模板，利用Primer5软件设计用于扩增获得启动子区5段缺失片段(P1-P5)的5条上游缺失片段引物(P1F-P5F)和1条共用的下游引物PR，每条上游引物的5’端添加MluI(A本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.转录因子MyoD在调控猪RTL1基因表达中的应用。

【技术特征摘要】
1.转录因子MyoD在调控猪RTL1基因表达中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，转录因子MyoD对RTL1基因的启动子活性具有抑制作用。3.一种抑制转录因子MyoD表达的siRNA，其特征在于，其为以下三条siRNA中的至少一种：siRNA1，其正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，其反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；siRNA2，其正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，其反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；siRNA3，其正义链的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示，其反义链的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。4.如权利要求3所述的抑制RTL1基因表达的siRNA，其特征在于，所述siRNA为siRNA2。5.如权利要求3所述的抑制RTL1基因表达的siRNA，...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔木，武华玉，彭先文，吴俊静，梅书棋，刘贵生，周佳伟，孙华，宋忠旭，胡华，李良华，董斌科，赵海忠，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42