特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用。本发明专利技术保护一种多肽，如序列表的序列1所示。编码所述多肽的核酸分子也属于本发明专利技术的保护范围。本发明专利技术还保护表达所述多肽的重组间充质干细胞。本发明专利技术还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述重组间充质干细胞；所述产品的用途为治疗自身免疫性疾病。本发明专利技术对于自身免疫性疾病的治疗具有重大的应用价值。

Specific short peptides, recombinant mesenchymal stem cells expressing specific short peptides and their applications

The invention discloses a specific short peptide, a recombinant mesenchymal stem cell expressing a specific short peptide and their application. The present invention protects a polypeptide, as shown in sequence 1 of the sequence list. The nucleic acid molecule encoding the polypeptide also belongs to the protection scope of the present invention. The invention also protects recombinant mesenchymal stem cells expressing the polypeptide. The invention also protects a product whose active ingredient is any of the above recombinant mesenchymal stem cells; the product is used for the treatment of autoimmune diseases. The invention has great application value for the treatment of autoimmune diseases.

【技术实现步骤摘要】
特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用
本专利技术涉及一种特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcell，MSC)是来源于胚胎中胚层的一类成体干细胞，除具有向多胚层细胞分化、促进损伤修复、抗炎以及神经营养等功能外，MSC还可减低以树突状细胞(dendriticcells,DC)为代表的单核巨噬细胞抗原递呈能力，具有免疫抑制作用。脐带间充质干细胞(umbilicalcoralderivemesenchymalstemcells，UC-MSCs)在特性上类似于骨髓间充质干细胞，但在增殖及分化潜能方面优于骨髓间充质干细胞、取材方便，容易工业化制备，是组织工程和再生医学理想的种子细胞。目前，用MSC治疗疾病的临床试验正在许多国家进行，但干细胞疗法的成功与否很大程度依赖足量的干细胞归巢到损伤组织，提高MSC归巢至靶器官是治疗疾病的关键。巨噬细胞在胶原诱导的关节炎、肾炎、甲状腺炎、变应性脑脊髓炎等实验性自身免疫性疾病的组织损伤中发挥着重要作用。骨髓来源的活化的巨噬细胞是实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimentalautoimmuneuveitis,EAU)组织损伤中主要的效应细胞。研究还发现DC位于正常的脉络膜组织中，有一部分DC在脉络膜视网膜的交接处，并与视网膜色素上皮(RPE)接近，提示这些DC与EAU肉芽肿的发生密切相关。在EAU中，相当数量的树突状细胞和单核巨噬细胞还渗入到脉络膜。骨髓来源的髓系DC是EAU中主要的抗原呈递细胞，而巨噬细胞并未行使抗原呈递的功能，而是在组织损伤中发挥了效应细胞和清除死亡细胞的功能。目前所有研究结果均提示抑制树突状细胞和单核巨噬细胞功能，改变免疫应答类型将是治疗EAU的一个有效途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种特异短肽、表达特异短肽的重组间充质干细胞以及它们的应用。本专利技术保护一种多肽，如序列表的序列1所示。编码所述多肽的核酸分子也属于本专利技术的保护范围。所述核酸分子具体如序列表的序列2所示。本专利技术还保护具有所述核酸分子的重组质粒。所述重组质粒具体可为重组质粒P2。重组质粒P2具体可为在载体GV287的BamHI和AgeI酶切位点之间插入序列表的序列5第5-52位核苷酸所示的DNA分子得到的重组质粒。重组质粒P2的构建方法具体如下：将序列表的序列5所示的单链DNA分子1和序列表的序列6所示的单链DNA分子2混合后进行退火，得到具有粘末端的双链DNA分子；用限制性内切酶BamHI和AgeI双酶切载体GV287,回收载体骨架；将具有粘末端的双链DNA分子和载体骨架连接，得到重组质粒P2。本专利技术还保护表达所述多肽的的重组慢病毒。所述重组慢病毒的制备方法如下：取293T细胞，共转染三种质粒，然后培养，得到重组慢病毒。所述三种质粒为重组质粒P2、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体。本专利技术还保护表达所述多肽的重组间充质干细胞。所述重组间充质干细胞是将所述重组慢病毒感染间充质干细胞得到的。所述重组间充质干细胞的制备方法具体如下：用含15％FBS的DMEM培养基培养间充质干细胞至细胞融合率为30％～50％，然后加入重组慢病毒的病毒液，然后加入polybrene并使其在体系中的浓度为5μg/mL，混匀、然后继续培养8～12h，然后更换培养基为新鲜的含15％FBS的DMEM培养基，继续培养；感染病毒液72小时后，收集细胞，即为表达所述多肽的重组间充质干细胞。所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。本专利技术还保护以上任一所述核酸分子，或，以上任一所述重组质粒，或，以上任一所述重组慢病毒，或，以上任一所述重组间充质干细胞在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病为自身免疫性葡萄膜炎。本专利技术还保护一种产品，其活性成分为以上任一所述重组间充质干细胞；所述产品的用途为治疗自身免疫性疾病。所述自身免疫性疾病为自身免疫性葡萄膜炎。本专利技术还保护所述多肽的应用，为促使间充质干细胞靶向单核巨噬细胞。所述单核巨噬细胞为树突状细胞。本专利技术对于自身免疫性疾病的治疗具有重大的应用价值。附图说明图1为实施例2中的细胞形态照片(倒置差显微镜下的细胞，200×)。图2为实施例2中观察荧光表达的细胞照片(荧光显微镜下的细胞，200×)。图3为实施例2中CD105/CD44和CD73/CD90分子在细胞表面的表达情况。图4为实施例3中小鼠眼部的照片。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。采用SPSS11.0统计软件分析处理。各组间数据的差异比较采用单因素的方差分析及组内数据的差异比较采用q检验。P<0.05为差异有统计学意义。载体GV28、pHelper1.0载体、pHelper2.0载体：吉凯基因。离体的新生儿脐带获自37～40周胎龄剖腹产健康胎儿，获得孕妇知情同意。IRBP片段即光感受器间维生素A类结合蛋白(interphotoreceptorretinoid-bindingprotein，IRBP)1169-1191位多肽片段，序列为：PTARSVGAADGSSWEGVGVVPDV。弗氏完全佐剂(completeFreund’sadjuvant，CFA)：Sigma。百日咳毒素(pertussistoxin，PTX)：Sigma。P2多肽(序列1)：SSEKAEQQWAGQ。P2多肽的编码基因(序列2)：5’-agcagtgaaaaggctgaacaacagtgggctggacaa-3’。P1多肽(序列3)：SSEKAEQQWA。P1多肽的编码基因(序列4)：5’-agcagtgaaaaggctgaacaacagtgggct-3’。实施例1、重组慢病毒病毒液的制备一、构建重组质粒1、将单链DNA分子1和单链DNA分子2混合后进行退火，得到具有粘末端的双链DNA分子。单链DNA分子1(序列表的序列5)：5’-GATCCCGCCACCATGagcagtgaaaaggctgaacaacagtgggctggacaaA-3’；单链DNA分子2(序列表的序列6)：5’-CCGGTttgtccagcccactgttgttcagccttttcactgctCATGGTGGCGG-3’。2、用限制性内切酶BamHI和AgeI双酶切载体GV287,回收载体骨架。3、将步骤1得到的具有粘末端的双链DNA分子和步骤2得到的载体骨架连接，得到重组质粒P2。根据测序结果对重组质粒P2进行结构描述如下：在载体GV287的BamHI和AgeI之间具有序列表的序列2所示的双链DNA分子。重组质粒P2中，外源插入的DNA分子与载体骨架上的GFP基因形成融合基因，表达具有序列表的序列1所示的P2多肽和GFP蛋白的融合蛋白。4、将单链DNA分子3和单链DNA分子4混合后进行退火，得到具有粘末端的双链DNA分子。单链DNA分子3：5’-GATCCCGCCACCATGAGCAGTGAAAAGGCTGAACAAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多肽，如序列表的序列1所示。

【技术特征摘要】
1.一种多肽，如序列表的序列1所示。2.编码权利要求1所述多肽的核酸分子。3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子如序列表的序列2所示。4.具有权利要求2或3所述核酸分子的重组质粒。5.表达权利要求1所述多肽的的重组慢病毒。6.表达权利要求1所述多肽的重组间充质干细胞。7.权利要求2或3所述核酸分子，或，权利要求4所述重组质粒，或，权利要求5所述重...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭建巍，秦力维，
申请(专利权)人：中国人民解放军海军总医院，
类型：发明
国别省市：北京,11