一种新型细胞重编程因子的表达与纯化方法技术

本发明专利技术披露一种新型细胞重编程因子的表达与纯化方法，本发明专利技术利用基因工程技术在小鼠Oct4基因5’末端引入小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)和细胞穿膜肽(TAT)。通过体外融合表达及酶切纯化，获得大量具备穿膜活性的TAT‑Oct4蛋白，为实现利用重编程因子蛋白诱导体细胞重编程为iPS细胞，并为最终获得用于产生血小板的前体细胞奠定基础；本发明专利技术的蛋白或核苷酸序列可以用于诱导产生iPS细胞。

A New Method of Expression and Purification of Cell Reprogramming Factor

The invention discloses a novel method for expression and purification of cell reprogramming factor. The invention introduces small molecular ubiquitin-like modified protein (SUMO) and cell penetrating peptide (TAT) at the 5'end of mouse Oct4 gene by genetic engineering technology. A large number of TAT Oct4 proteins with membrane penetrating activity were obtained by in vitro fusion expression and enzyme digestion purification, which laid the foundation for realizing reprogramming of somatic cells into iPS cells by reprogramming factor proteins and eventually obtaining precursor cells for platelet production. The protein or nucleotide sequence of the invention can be used to induce the production of iPS cells.

【技术实现步骤摘要】
一种新型细胞重编程因子的表达与纯化方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种新型细胞重编程因子的表达与纯化方法。专利技术背景目前用来诱导多能干细胞(iPS)的主要重编程转录因子为Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四因子。这些转录因子能关闭自己组织特异性细胞的功能，同时成功激活多能性细胞的特征。在胚胎干细胞(ESC)中进行研究OSKM与染色质的相互作用，发现Oct4，Sox2和Klf4优先结合增强子，c-Myc主要与启动子结合。转录因子Oct4，也称为OCT3、OCT3/4、OTF3和OTF4，由Pou5F1基因编码产生，它作为主调节器维持胚胎干的多能性和自我更新能力。Oct4蛋白定位于第17号染色体上，编码352个氨基酸，蛋白质分子量约为40kDa。Oct4调控基因的表达以维持干细胞未分化状态，在分化过程中通过RNA干扰抑制Oct4的表达可使干细胞分化。当Oct4作为激活剂时，发挥诱导和维持多能性的功能；当Oct4转化为强激活剂时，更有效地支持多能性；当Oct4转化为阻遏物时，诱导分化。Marikawa等研究了Oct4在小鼠P19胚胎癌(EC)细胞中的作用，Oct4通过2种抵消作用维持P19EC细胞的多能性：一种是抑制中胚层诱导的Wnt/β-连环蛋白信号传导，另一种是提供Brachyury基因响应Wnt/β-连环蛋白信号的能力。研究结果证实，Oct4是重编程中必需的因子，并且单个Oct4足以直接将神经干细胞重编程为多能性。继神经干细胞之后，Wu等仅使用一个转录因子Oct4足以将滋养外胚层来源的滋养层干细胞重编程为具有分化为三胚层能力的多潜能干细胞。过去一直认为，一旦Oct4蛋白水平降低，就会使得新生干细胞的数量随之下降。英国科学家最新研究发现，Oct4控制着胚胎形成早期的基因表达，在其水平下降时会诱发胚胎干细胞进行自我更新，从而使干细胞数量保持在一个均衡状态。小分子泛素样修饰蛋白(smallubiquitin-likemodifier,SUMO)是一类与泛素在结构上十分相似的小分子多肽，由约100个氨基酸残基组成，广泛存在于真核生物中。SUMO在物种进化过程中高度保守，其基因全长318bp，蛋白分子量大小约12kDa。SUMO主要通过共价修饰的方式来调节靶蛋白的结构与功能。SUMO最先是以没有活性的前体形式存在，在某种特异性蛋白酶的水解作用下，C-末端的数个氨基酸被切除，暴露出C-端的Gly-Gly残基，从而成为具有修饰、转运等功能的成熟SUMO，然后与靶蛋白上的赖氨酸ε-氨基结合形成异肽键发挥作用，此过程为SUMO化。SUMO对蛋白质的修饰是一种动态可逆的过程。SUMO与蛋白结合后，可以通过切断异肽键将SUMO从靶蛋白上切除，此过程为去SUMO化。在细胞中，SUMO的数量往往是有限的，因此在去SUMO化的同时也提供了更多的SUMO来修饰其他的底物蛋白。SUMO已被证实可作为标签和分子伴侣应用到重组蛋白的融合表达中，并且具有增强蛋白质表达，减少靶蛋白的降解，增加蛋白质折叠和溶解度以及简化纯化和检测的优势。因此，本专利技术引入SUMO将有利于获得高效表达的重组蛋白。细胞穿膜肽(cell-penetratingpeptides，CPPs)是一类能携带多种生物活性物质快速进入细胞的小分子短肽，长度一般不超过30个氨基酸且富含碱性氨基酸。因其穿膜能力不依赖经典的胞吞作用直接穿过细胞膜进入细胞，所以常作为靶向药物的良好载体。根据其来源主要可分为两大类，一类是天然存在的，如来源于人类免疫缺陷病毒HIV-1的反式转录激活因子TAT(trans-activatoroftranscription,TAT)、果蝇同源异型的ANTP和单纯疱疹病毒HSV-1的VP22；另一类为人工合成的，如多聚精氨酸和多聚赖氨酸，或者对天然细胞穿膜肽进行修饰而成的，如MPG、pep-1等。TAT是最早被发现且目前应用最为广泛的细胞穿膜肽。TAT蛋白由86～102个氨基酸组成，其中保持其具有穿膜活性的片段只包含11个氨基酸，位于第47～57位的氨基酸残基，其序列为YGRKKRRQRRR，去除任意一个精氨酸都会使其穿膜活性降低。研究表明，利用TAT介导蛋白质转导哺乳动物细胞的转导率达100％，并且该转录效应是可逆的，没有不利影响。因此，本专利技术引入细胞穿膜肽TAT，将TAT与转录因子进行融合表达，利用细胞穿膜肽能携带外源性生物大分子物质进入细胞的穿膜活性，从而高效地将转录因子带入细胞内发挥功能获得iPS细胞。为了使进入胞质内的OCT4充分发挥其生物活性，在OCT4与TAT间插入了NT4信号肽序列，使得TAT介导OCT4进入细胞内后，信号肽NT4内有内肽酶裂解点，有再切割作用，可使目的蛋白能够被内肽酶裂解分离到细胞质内部，从而使OCT4从融合蛋白中释放出来，发挥其原有的生物活性。
技术实现思路
本专利技术目的在于找到一种对细胞具有重编程能力的蛋白质。本专利技术的目的还在于提供一种含有编码本专利技术蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA或含有该DNA的载体或质粒。本专利技术的再一个目的在于提供本专利技术蛋白质的用途，包括制药用途和治疗疾病的用途。本专利技术拟建立能高效表达SUMO融合的携带细胞穿膜肽的OSKM四因子原核表达系统。利用大肠杆菌Rossate(DE3)高效表达Su-TN-Oct4融合蛋白，使其在SUMO的融合表达下以期增加目的蛋白的表达量和可溶性，并以期提高转录因子的生物活性；同时通过引入TAT以期提升四因子的穿膜效率，而且为充分发挥OCT4的功能，在TAT与OCT4之间，加入了信号肽NT4序列，以使融合蛋白进入细胞后将NT4切除，从而产生具有天然氨基酸末端的OCT4，从而改善诱导iPS细胞的效果。为后期拟利用转录因子蛋白进行体细胞重编程打下坚实基础，继而将iPS细胞诱导形成血小板的前体细胞，从而满足临床对血小板的需求。其核苷酸编码序列见序列表中的SEQIDNO.:1(下文简称“序列1”)，其氨基酸序列见序列表中的SEQIDNO.:2(下文简称“序列2”)。本专利技术还提供该OCT4蛋白质的衍生物，包括那些具有可对细胞进行重编程作用的蛋白，其氨基酸序列为序列2所示氨基酸序列的突变体、序列2的保守取代形式、增加或缺失一个或几个氨基酸的形式、氨基端截断的形式、羧基端截断的形式、序列2的部分或全部串联重复形式以及与其他蛋白质和细胞因子的融合蛋白形式。在本申请文本所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37,1984)。具体而言，首先根据OCT4的cDNA编码序列设计与其两端对应的引物OCT-F和OCT-R，并分别在引物中加入适宜的酶切位点。以人体总DNA为模板，扩增并分离出1059bp的cDNA，命名为OCT4，编码352个氨基酸。将插入片段进行核苷酸序列测定，然后氨基酸编码分析，结果分别如序列1和2所示。随后，用搭桥PCR技术将Sumo基因、TAT序列、NT4克隆进pET-3C中，得到pET-HisSu-TN，将OCT4基因通过KpnI和BglII双酶切后克隆进经KpnI和BamHI双酶切的载体pET-HisSu-TN中得到pET-HisSu-TN-Oct4，并将此表达载体转化大肠杆菌Ro本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离的人源蛋白质，其特征在于，具有352个氨基酸，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种分离的人源蛋白质，其特征在于，具有352个氨基酸，其氨基酸序列如序列表SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的分离的人源蛋白质，其特征在于其氨基端前面具有TAT序列及NT4序列。3.根据权利要求1所述的分离的人源蛋白质，其特征在于，所述的氨基酸序列由如下核苷酸序列编码：ATGGCTGGACACCTGGCTTCAGACTTCGCCTTCTCACCCCCACCAGGTGGGGGTGATGGGTCAGCAGGGCTGGAGCCGGGCTGGGTGGATCCTCGAACCTGGCTAAGCTTCCAAGGGCCTCCAGGTGGGCCTGGAATCGGACCAGGCTCAGAGGTATTGGGGATCTCCCCATGTCCGCCCGCATACGAGTTCTGCGGAGGGATGGCATACTGTGGACCTCAGGTTGGACTGGGCCTAGTCCCCCAAGTTGGCGTGGAGACTTTGCAGCCTGAGGGCCAGGCAGGAGCACGAGTGGAAAGCAACTCAGAGGGAACCTCCTCTGAGCCCTGTGCCGACCGCCCCAATGCCGTGAAGTTGGAGAAGGTGGAACCAACTCCCGAGGAGTCCCAGGACATGAAAGCCCTGCAGAAGGAGCTAGAACAGTTTGCCAAGCTGCTGAAGCAGAAGAGGATCACCTTGGGGTACACCCAGGCCGACGTGGGGCTCACCCTGGGCGTTCTCTTTGGAAAGGTGTTCAGCCAGACCACCATCTGTCGCTTCGAGGCCTTGCAGCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：庞实锋，林灼锋，庞锦锋，曹定国，梁朋，丁银润，张国平，何滔，
申请(专利权)人：广东医科大学，
类型：发明
国别省市：广东,44