短型视杆源性视锥活力因子与亲水性肽的融合蛋白制造技术

本发明专利技术描述了包含第一N端信号肽序列、位于该信号肽序列C端的第二肽序列和位于第二肽序列C端的第三肽序列的融合蛋白，其中第二肽序列和第三肽序列中的一个是RdCVF‑短肽序列，而另一个是亲水性肽序列。在翻译后，信号肽被切除，留下包含第二肽序列和第三肽序列而不带信号肽的融合蛋白。本发明专利技术还描述了编码所述融合蛋白的核酸和表达载体、包含所述核酸或表达载体的细胞，以及所述融合蛋白、核酸和表达载体的治疗方法和用途。所述融合蛋白可以通过在允许表达和分泌编码的融合蛋白的条件下培养本发明专利技术的细胞并从细胞培养物中分离出该融合蛋白来在体外制备。

Fusion protein of short rod-derived cone activity factor and hydrophilic peptide

The present invention describes a fusion protein comprising a first N-terminal signal peptide sequence, a second peptide sequence at the C-terminal of the signal peptide sequence and a third peptide sequence at the C-terminal of the second peptide sequence, in which one of the second and third peptide sequences is a RdCVF short peptide sequence and the other is a hydrophilic peptide sequence. After translation, the signal peptide was removed, leaving the fusion protein containing the second and third peptide sequences without signal peptide. The present invention also describes the nucleic acid and expression vector encoding the fusion protein, the cells containing the nucleic acid or expression vector, and the therapeutic methods and uses of the fusion protein, nucleic acid and expression vector. The fusion protein can be prepared in vitro by culturing the cells of the present invention and isolating the fusion protein from the cell culture under the condition of allowing the expression and secretion of the encoded fusion protein.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】短型视杆源性视锥活力因子与亲水性肽的融合蛋白序列表的引用以附录C/ST.25文本文件的形式电子提交且文件参考号为WOC-019PCT的序列表是本公开的一部分。
技术介绍
RdCVF是由视网膜中的视杆感光细胞特异性表达的硫氧还蛋白样蛋白(Léveillard等，(2004)NatureGenetics36:755-759及补充信息)。在人类中有两种不同RdCVF，被称为RdCVF1和RdCVF2。两种RdCVF基因都经选择性剪接来编码两种产物：全长蛋白和C端转录后截短的蛋白，分别称为RdCVF-长(RdCVFL)和RdCVF-短(RdCVFS)。核氧还蛋白样-1基因(Nxnl1)通过选择性剪接机制编码长型和短型RdCVF。Nxnl1敲除导致小鼠中视杆和视锥的逐渐丧失，表明在基因水平上该基因对于感光细胞的存活以及维持正确的视网膜生理学和功能是至关重要的。RdCVFS被描述为是促进视锥存活的分泌型营养因子，而RdCVFL是与细胞内蛋白相互作用的氧化还原活性酶(Léveillard等，(2010)SciTranslMed.2(26):26ps16)。例如，tau被描述为RdCVF-L的结合伴侣，而tau仅位于细胞内(Fridlich等，(2009)Molecular&CellularProteomics8(6):1206-18)。已发现，罹患某些视网膜营养不良的个体比未患视网膜营养不良的个体在眼中具有更低水平的RdCVF蛋白(PCT公开WO02/081513)。已证明不同形式的RdCVF蛋白能促进体外和体内的视锥感光细胞存活。例如，在遗传性视网膜退化的动物模型中，眼内注射短型人RdCVF1(RdCVF1S)蛋白不仅挽救了视锥细胞免于退化，而且还维持了其功能(Yang等，(2009)MolTherapy17:787-795)。然而，表现出该蛋白的体内视锥细胞保护效果需要多次眼内注射。色素性视网膜炎(RP)是以进行性视杆退化和随后的继发性视锥丧失为特征的视网膜退行性眼病。RP是遗传性失明的主要成因，仅在美国就影响着约10万患者和每年2000例新病例。RP影响所有族裔。全世界有超过150万人受RP影响。对于患者而言不幸的是，对RP没有有效疗法或经批准的疗法。因此，RP仍是迫切而未达成的医学需求。由于RP是临床进程为数年至数十年的慢性视网膜退行性疾病，通过在视网膜中组成型地表达RdCVF，基因疗法对于RP适应证可以是理想的。对于急性紧急适应证(例如视网膜脱落)，蛋白疗法可以是有益的。即，在视网膜可以重新连接至眼的背部(即，视网膜色素上皮和脉络膜层)之前，使用重组RdCVF蛋白来保护感光细胞免于死亡。不幸的是，本领域的科学家在有效表达和分泌RdCVF蛋白、尤其是短型RdCVF时遇到了相当的困难。参见例如美国专利公开第20110034546号第[0004]段。
技术实现思路
本专利技术提供了一种融合蛋白，其包含：第一N端信号肽序列、位于所述信号肽序列的C端的第二肽序列和位于所述第二肽序列的C端的第三肽序列；其中，所述第二肽序列和所述第三肽序列中的一个是RdCVF-短肽序列，而另一个是亲水性肽序列。翻译后，信号肽在内质网中被切下，留下包含第二肽序列和第三肽序列而缺少信号肽的融合蛋白。因此，本专利技术还提供了一种融合蛋白，其包含第二肽序列和位于所述第二肽序列C端的第三肽序列；其中，所述第二肽序列和所述第三肽序列中的一个是RdCVF-短肽序列，而另一个是亲水性肽序列。本专利技术还提供了编码所述融合蛋白的核酸和表达载体、包含所述核酸或表达载体的细胞以及所述融合蛋白、核酸和表达载体的治疗方法和用途。本专利技术还提供了一种制备融合蛋白的方法，该方法包括在允许表达和分泌所编码的融合蛋白的条件下培养本专利技术的细胞并从细胞培养物中分离出所述融合蛋白。附图说明图1A显示了人短型视杆源性视锥活力因子的氨基酸序列。人短RdCVF的氨基酸组成是高度疏水性的。短RdCVF中38.5％的氨基酸为疏水性的。下划线的氨基酸为疏水性氨基酸。图1B显示了人长型视杆源性视锥活力因子的氨基酸序列。长RdCVF的C端的25％的氨基酸为疏水性的(下划线的氨基酸为长型RdCVF的C端的疏水性氨基酸)。图2.短RdCVF与亲水性结构域的融合蛋白。图2显示了两种人短RdCVF融合蛋白的示意图。人短RdCVF在其N端或C端与亲水性结构域融合。融合蛋白具有信号肽以促进从细胞中分泌。图3.人白蛋白与人短RdCVF的新型融合蛋白的表达和分泌。图3显示了对人短RdCVF和人白蛋白融合蛋白的Western印迹分析。泳道1:来自用AAV-GFP(作为对照的编码GFP的AAV载体)转导的人293细胞的30μL细胞培养基；泳道2:来自用AAV-ALB-RdCVFS(编码在短RdCVF的N端与人白蛋白融合的短型人RdCVF的AAV载体)转导的人293细胞的30μL细胞培养基；泳道3:来自用AAV-RdCVFS-ALB(编码在短RdCVF的C端与人白蛋白融合的短型人RdCVF的AAV载体)转导的人293细胞的30μL细胞培养基。左侧的数字指示以kDa计的分子量标志物。序列表说明SEQIDNO:1.人白蛋白与短RdCVF的融合蛋白(ALB-RdCVFS)的氨基酸序列，其中人白蛋白位于融合蛋白的N端。SEQIDNO:2.编码在N端与人白蛋白融合的人短RdCVF(ALB-RdCVFS)的核苷酸序列。SEQIDNO:3.人白蛋白与短RdCVF的融合蛋白(RdCVFS-ALB)的氨基酸序列，其中人白蛋白位于融合蛋白的C端。在RdCVFS和人白蛋白之间存在4个氨基酸的间隔序列。自N端起的前21个氨基酸是来自小鼠Igk的信号序列。在信号序列和RdCVFS之间存在14个氨基酸的间隔序列(连接序列)。SEQIDNO:4.编码在C端与人白蛋白融合的人短RdCVF(RdCVFS-ALB)的核苷酸序列。SEQIDNO:5.人短型视杆源性视锥活力因子的氨基酸序列。SEQIDNO:6.人长型视杆源性视锥活力因子的氨基酸序列。具体实施方式不希望受理论束缚，表达和分泌短型RdCVF的困难可能潜在地归因于其高度疏水性的氨基酸组成。仔细分析短型和长型人RdCVF蛋白的氨基酸组成发现，短型RdCVF蛋白极度疏水(图1A和1B)。在短RdCVF中，109个氨基酸中的42个(38.5％)是疏水性氨基酸。存在一段6个疏水性氨基酸的片段、一段4个疏水性氨基酸的片段、以及两段各有3个疏水性氨基酸的片段。非常可能的是，高百分比的疏水性氨基酸组成使得短RdCVF极难在体外和体内被哺乳动物细胞高效地表达和分泌，因为其更可能通过疏水-疏水相互作用粘附于脂质膜。有趣的是，虽然长型RdCVF的N端的109个氨基酸与整个短RdCVF相同，但长RdCVF的C端的103个氨基酸不是疏水性的，仅有25％的氨基酸为疏水性的(26/103)。长RdCVF的该C端中的最长的疏水性氨基酸片段仅为4个氨基酸长。不存在3疏水氨基酸片段。长RdCVF的C端中的相对亲水性可能在减少长RdCVF的总体疏水性方面起着重要作用。在本专利技术的融合蛋白的一个实施方式中，第二肽序列是RdCVF-短肽序列而第三肽序列是亲水性肽序列。在另一个实施方式中，第二肽序列是亲水性肽序列而第三肽序列是RdCV本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种融合蛋白，其包含：(a)第一N端信号肽序列、位于所述信号肽序列的C端的第二肽序列和位于所述第二肽序列的C端的第三肽序列；或(b)第二肽序列和位于所述第二肽序列的C端的第三肽序列；其中，所述第二肽序列和所述第三肽序列中的一个是RdCVF‑短肽序列，而另一个是亲水性肽序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.11 US 62/406,5521.一种融合蛋白，其包含：(a)第一N端信号肽序列、位于所述信号肽序列的C端的第二肽序列和位于所述第二肽序列的C端的第三肽序列；或(b)第二肽序列和位于所述第二肽序列的C端的第三肽序列；其中，所述第二肽序列和所述第三肽序列中的一个是RdCVF-短肽序列，而另一个是亲水性肽序列。2.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第二肽序列是RdCVF-短肽序列，且所述第三肽序列是亲水性肽序列。3.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第二肽序列是亲水性肽序列，且所述第三肽序列是RdCVF-短肽序列。4.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述信号肽序列是人信号肽序列。5.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述信号肽序列选自由Igk信号肽序列和白蛋白信号肽序列组成的组。6.如权利要求5所述的融合蛋白，其中，所述白蛋白信号肽序列是人白蛋白信号肽序列。7.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述RdCVF-短肽序列是人RdCVF-短肽序列。8.如权利要求7所述的融合蛋白，其中，所述RdCVF-短肽序列选自由RdCVF1-短肽序列和RdCVF2-短肽序列组成的组。9.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述亲水性肽序列选自由亲水性蛋白、亲水性蛋白结构域、亲水性寡肽和亲水性多肽组成的组。10.如权利要求9所述的融合蛋白，其中，所述亲水性肽序列是白蛋白。11.如权利要求10所述的融合蛋白，其中，所述白蛋白是人白蛋白。12.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述亲水性肽序列对人不具有免疫原性。13.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的疏水性指数小于-0.20。14.如权利要求13所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白的疏水性指数小于-0.30。15.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第一肽序列与所述第二肽序列通过单一肽键共价键合。16.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，在所述第一肽序列与所述第二肽序列之间存在间隔序列。17.如权利要求16所述的融合蛋白，其中，所述第一肽序列与所述第二肽序列之间的所述间隔序列具有2至14个氨基酸。18.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第二肽序列与所述第三肽序列通过单一肽键共价键合。19.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，在所述第二肽序列与所述第三肽序列之间存在间隔序列。20.如权利要求19所述的融合蛋白，其中，所述第二肽序列与所述第三肽序列之间的所述间隔序列具有2至4个氨基酸。21.如权利要求1所述的融合蛋白，所述融合蛋白还包含位于所述第三肽序列的C端的多腺苷酸化信号。22.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第一肽序列是人白蛋白信号序列，所述第二肽序列是人白蛋白，且所述第三肽序列是RdCVF-短序列。23.如权利要求22所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白具有序列SEQIDNO:1，或SEQIDNO:1的第25-717号氨基酸。24.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述第一肽序列是Igk信号序列，所述第二肽序列是RdCVF-短序列，且所述第三肽序列是人白蛋白。25.如权利要求24所述的融合蛋白，其中，所述融合蛋白具有序列SEQIDNO:3，或SEQIDNO:3的第22-732号氨基酸。26.如权利要求1所述的融合蛋白，其中，所述信号肽序列、所述RdCVF-短肽序列和所述亲水性肽序列中的一个、两个或全部与相应的野生型序列不同。27.如权利要求26所述的融合蛋白，其中，所述信号肽序列、所述RdCVF-短肽序列和所述亲水性肽序列中的一个、两个或全部与相应的野生型序列的差别在于一个或多个保守性氨基酸替换。28.编...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗天赐，张俊，
申请(专利权)人：威尔斯达眼科制剂公司，
类型：发明
国别省市：美国,US