超低分子角蛋白肽的制备方法及其的利用技术

本发明专利技术涉及超低分子角蛋白肽的制备方法及其的利用。上述超低分子角蛋白肽的制备方法利用包含角蛋白的培养基中的具有角蛋白分解活性的微生物的培养、超滤法、离子交换色谱法及凝胶过滤色谱法。根据本发明专利技术的角蛋白肽制备方法，可实现废弃资源的环保生物学处理及抗老化功能性超低分子角蛋白肽的有效的纯化及回收。并且，本发明专利技术的角蛋白肽通过分解胶原蛋白，来具有作为引起皮肤老化的酶的基质金属蛋白酶‑1的表达抑制能力和活性抑制能力，防止皮肤老化及改善皮肤皱纹的效果优秀，对皮肤细胞无毒性，从而适合用作皮肤皱纹的预防、改善或治疗用化妆品、药学、食品组合物，从而可有用地适用于高附加值功能性化妆品材料的有效且快速的制备及开发。

Preparation and Utilization of Ultra-Low Molecular Keratin Peptide

The invention relates to a preparation method of ultra-low molecular keratin peptide and its utilization. The preparation method of the ultra-low molecular weight keratin peptide is culturing, ultrafiltration, ion exchange chromatography and gel filtration chromatography using microorganisms containing keratin decomposing activity in the culture medium containing keratin. According to the preparation method of the keratin peptide according to the present invention, the environmental protection biological treatment of waste resources and the effective purification and recovery of the anti-aging functional ultra-low molecular keratin peptide can be realized. Moreover, the keratin peptide of the present invention has the ability of expression inhibition and activity inhibition of matrix metalloproteinase 1 as an enzyme causing skin aging by decomposing collagen. It has excellent effect of preventing skin aging and improving skin wrinkles, and is non-toxic to skin cells. Therefore, it is suitable for the combination of cosmetics, pharmaceuticals and food for preventing, improving or treating skin wrinkles. Therefore, it can be applied to the effective and rapid preparation and development of high value-added functional cosmetic materials.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】超低分子角蛋白肽的制备方法及其的利用
本专利技术涉及超低分子角蛋白肽的制备方法及其的利用。具体地，本专利技术涉及利用包含角蛋白的培养基中的具有角蛋白分解活性的微生物的培养、超滤、离子交换色谱及凝胶过滤色谱的超低分子角蛋白肽制备方法，以及通过上述方法制备而成的肽及包含其的皮肤老化或皮肤皱纹预防或改善用化妆品、食品组合物。
技术介绍
随着男女老少均对具有弹力且美丽的皮肤的关注度增加，在化妆品市场中，从现有的以健康为中心的化妆品越来越趋向可满足对美丽的渴望且有助于皱纹改善的功能性材料的发掘。尤其，角蛋白肽作为形成毛发、指甲、皮肤等形成上皮结构的基本的天然的氨基酸聚合物（50个以下氨基酸），由于与生物体内蛋白质的相互作用非常优秀，因此具有多种生理活性。最近，因化妆品制备技术的均衡化，含有差别化的天然成分的新材料开发在化妆品产业中成为核心的话题，从而对作为天然材料的角蛋白肽的功能性高度关注。但是，在韩国国内，因对全量进口的功能性肽的原料的价格负担（每1kg为2亿韩元～30亿韩元）功能性肽化妆品开发非常慢，大部分情况下即使含有肽，也只不过含有极少量。在以人类或家畜的疾病治疗为目的所使用的医疗用肽（包括疫苗）的情况下，尽管是极微量，但大部分都是高价产品。即使是功效非常优秀的肽，也大部分为大小由15个以上的氨基酸组成的聚合物（分子量为3kDa以上），从而皮肤角质渗透性向细胞内部的吸收不容易。因此，在肽新材料开发中最核心的要素为1）肽的功效、2）肽的大小（分子量）、3）确定生产成本的选择性分离及高纯度纯化技术。当前，为了产业上利用的低分子肽的分离及制备，依赖于超滤膜，在高价的医药用肽的情况下，通过复杂的色谱法进行纯粹分离而使用。通常，为了对通过合成方法或重组方法生产的高分子进行纯化，如肽及蛋白质等，典型地，为利用疏水性相互作用的反相液相色谱法（“RP-LC”：reversephaseliquidchromatography）及反相高效液相色谱法（“RP-HPLC”：reversephasehigh-performanceliquidchromatography）。反相液相色谱法及反相高效液相色谱法可有效地分离密切相关的杂质，并且可对多个多种分子进行纯化，尤其，利用为用于制备产业规模的蛋白质的大量纯化工序。尤其，为了纯化肽蛋白纯化，在反相色谱法中，作为媒质最普遍使用附着于二氧化硅表面的C-4、C-8及C-18烷基链。在这种反相液相色谱法中纯化的核心为固定相的树脂粒子的形状、大小、缓冲液类、流量、pH等。在蛋白质纯化中，虽然进行这种技术改善，但是在一部分经纯化的蛋白质中仍然存在相当量的杂质（比如，具有相反离子）。尤其，为了开发不是医药用的功能性化妆品材料，利用如上所述的高价的设备的分离方法在经济性及生产性方面非常低，从而在实际产业的适用中存在其局限。因此，为了开发来源于天然的功能性化妆品肽新材料，非常需要可有效且迅速地取得具有功效的功能性超低分子肽，同时需要经济、简单的色谱纯化工序的开发。
技术实现思路
对此，本专利技术人锐意努力开发从难分解性角蛋白分解产物可回收、分离具有皮肤抗老化功效的功能性角蛋白肽的工序，并开发纯化工序，选择性地对无需传递系统可有效且自由地渗透皮肤角质层和细胞膜的水平的超低分子肽进行分离。因此，本专利技术的一实施方式提供用于制备皮肤老化或皮肤皱纹预防用角蛋白肽的方法，在包含角蛋白的培养基中，培养具有角蛋白分解活性的微生物，并利用超滤法、离子交换色谱法及凝胶过滤色谱法。并且，本专利技术的一实施方式提供由上述方法制备而成的角蛋白肽及包含其的皮肤老化或皮肤皱纹预防或改善用化妆品组合物、食品组合物。并且，本专利技术的一实施方式提供由选自由序列1至序列9组成的组中的一种以上的序列表示的肽及包含上述肽的皮肤老化或皮肤皱纹预防或改善用化妆品组合物、食品组合物。本专利技术的一实施方式提供皮肤老化或皮肤皱纹预防用角蛋白肽混合物的制备方法，上述皮肤老化或皮肤皱纹预防用角蛋白肽混合物的制备方法包括：步骤（1），在包含角蛋白的培养基中，通过培养具有角蛋白分解活性的微生物，来取得角蛋白水解产物；步骤（2），在从上述步骤（1）取得的角蛋白水解产物中分馏分子量为100Da至1000Da的蛋白质；步骤（3），通过对从上述步骤（2）取得的分馏产物进行离子交换色谱、凝胶过滤色谱或其的组合来纯化蛋白质；以及步骤（4），通过对从步骤（3）取得的经纯化的蛋白质进行凝胶过滤色谱，来对蛋白质进行纯化及脱盐。以下详细说明本专利技术。本专利技术的专利技术人在作为营养源来添加难分解性家禽类羽毛的最小限度培养基中，通过超高温厌氧发酵有效取得角蛋白分解产物，从而大量获得具有皮肤抗老化功效的角蛋白肽。并且，通过使用超滤（ultrafiltration），来对水解产物来分子量进行分馏，从而大量回收超低分子（1kDa以下）角蛋白肽。并且，利用离子交换色谱及凝胶过滤色谱对这种超低分子角蛋白肽进行分离及纯化，进而，通过简化纯化步骤，来仅利用凝胶过滤色谱法分离及纯化超低分子角蛋白肽。并且，确认这种肽不呈现细胞毒性，并具有基质金属蛋白酶-1（MMP-1）的活性抑制能力和表达抑制能力，这些肽具有抗老化功能性，皮肤角质渗透性优秀，因而确认可利用于皮肤皱纹或皮肤老化的预防或改善。以下，对本专利技术的步骤进行详细说明。本专利技术的步骤（1）为如下步骤：在包含角蛋白的培养基中，通过培养具有角蛋白分解活性的微生物，来取得角蛋白水解产物。在本专利技术中，“具有角蛋白分解活性的微生物”无限制地包含具有可分解角蛋白的活性的微生物，优选地，可以为超高温微生物。在本专利技术中使用的术语“超高温微生物”是指作为极端生物（extremophile）的一种，在相对高的温度，即，在约60℃以上中具有最优生育温度的微生物，并不限制其种类。优选地，可以为闪烁杆菌属（Fervidobacterium）。作为上述闪烁杆菌属可以为岛青霉素（islandicum）、青霉普兰（pennivorans）、长白昆（changbaicum）、坤德瓦斯（gondwanense）种。最优选地，可利用海岛闪烁杆菌（Fervidobacteriumislandicum）AW-1（KCTC4680）。在本专利技术中使用的术语“角蛋白（keratin）”作为结构蛋白的一种，是形成细胞骨架的主要组成成分。角蛋白根据半胱氨酸含量区分为软角蛋白（softkeratin）和硬角蛋白（hardkeratin）。软角蛋白的半胱氨酸为约10～14％，是二硫化（disulfide）键多的头发、指甲、羊毛、鸡毛等。角蛋白的α-螺旋（α-角蛋白）或β-折叠（β-角蛋白）的结构相互缠绞，从而蛋白链非常坚固地堆积，在聚肽物之间存在很多二硫键、氢键及疏水性相互作用，从而非常稳定，并对蛋白分解酶的抵抗性大。本专利技术的角蛋白可来源于鸟类或哺乳类的羽毛、毛发、皮革、指甲、爪、角或蹄。优选地，可在培养基中包含鸟类的羽毛来利用。优选地，在培养基中包含5～15g/L的上述鸟类的羽毛，更优选地，包含8g/L。在以上述的范围包含其含量的情况下，可在1～2日内实现通过厌氧培养的角蛋白肽的生产，并更有利于取得适当的大小的功能性角蛋白肽。上述培养可以为60℃以上的高温培养。上述培养温度无其限制，优选地，可以为60℃至90℃。上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种皮肤老化或皮肤皱纹预防用角蛋白肽混合物的制备方法，其特征在于，包括：步骤（1），在包含角蛋白的培养基中，通过培养具有角蛋白分解活性的微生物，来取得角蛋白水解产物；步骤（2），在从上述步骤（1）取得的角蛋白水解产物中分馏分子量为100Da至1000Da的蛋白质；步骤（3），通过对从上述步骤（2）取得的分馏产物进行离子交换色谱、凝胶过滤色谱或其的组合来纯化蛋白质；以及步骤（4），通过对从步骤（3）取得的经纯化的蛋白质进行凝胶过滤色谱，来对蛋白质进行纯化及脱盐。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.10.29 KR 10-2015-01506181.一种皮肤老化或皮肤皱纹预防用角蛋白肽混合物的制备方法，其特征在于，包括：步骤（1），在包含角蛋白的培养基中，通过培养具有角蛋白分解活性的微生物，来取得角蛋白水解产物；步骤（2），在从上述步骤（1）取得的角蛋白水解产物中分馏分子量为100Da至1000Da的蛋白质；步骤（3），通过对从上述步骤（2）取得的分馏产物进行离子交换色谱、凝胶过滤色谱或其的组合来纯化蛋白质；以及步骤（4），通过对从步骤（3）取得的经纯化的蛋白质进行凝胶过滤色谱，来对蛋白质进行纯化及脱盐。2.根据权利要求1所述的皮肤老化或皮肤皱纹预防用角蛋白肽混合物的制备方法，其特征在于，上述步骤（1）的微生物为海岛闪烁杆菌AW-1（KCTC4680）。3.根据权利要求1所述的皮肤老化或皮肤皱纹预防用角蛋白肽混合物的制备方法，其特征在于，上述步骤（1）的角蛋白来源于鸟类或哺乳类的羽毛、毛发、皮革、指甲、爪、角或蹄。4.根据权利要求1所述的皮肤老化或皮肤皱纹预防用角蛋白肽混合物的制备方法，其特征在于，上述步骤（1）的培养为在60℃至90℃的温度条件下进行的厌氧培养。5.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：李东佑，姜南朱，李勇直，陈炫秀，吕寅赫，宋京燮，李在恩，
申请(专利权)人：庆北大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR