分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本发明专利技术以E.coli MG1655为出发菌株，提供了一种在大肠杆菌中表达全长IgG抗体的方法，同时共表达了分子伴侣，促进全长IgG的正确形成，提高IgG抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。

Application of Molecular Chaperones in Promoting the Formation of Monoclonal Antibodies and/or Increasing the Expression of Monoclonal Antibodies

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to the application of molecular chaperones in promoting the formation of monoclonal antibodies and/or increasing the expression of monoclonal antibodies. Taking E.coli MG1655 as the starting strain, the invention provides a method for expressing full-length IgG antibody in E.coli, and co-expresses molecular chaperones, promotes the correct formation of full-length IgG, improves the production of IgG antibody, and provides a theoretical basis for future industrial production.

【技术实现步骤摘要】
分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。
技术介绍
单克隆抗体是生物制药行业最重要的组成部分之一，尤其是在自身免疫性疾病和肿瘤领域占据主要地位。截止2013年，有35种单克隆抗体获得美国FDA的批准，其中，免疫球蛋白G(IgG)占绝大多数。因此，人们对IgG的生产最为关注。单克隆抗体是一个由轻链LC和重链HC组装成的异四聚体蛋白质。根据不同的重链，可以将单克隆抗体分成5类免疫球蛋白：IgG、IgM、IgD、IgA和IgE。IgG抗体是由两个相同重链(HC)和两个相同轻链(LC)组成的对称抗体，每一个都通过二硫键相连。EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，是原癌基因C-ERBB1的表达产物。EGFR可以在细胞核中积累聚集，并对细胞增殖、DNA修复、肿瘤发生、炎症等产生影响。截止2017年1月，共有10种以EGFR为靶点的药物获得FDA批准上市，包括4种大分子药物(cetuximab、nimotuzumab、panitumumab和necitumumab)和6种小分子药物(erlotinib、gefitinib、lcotinib、afatinib、osimertinib和olmutinib)。Cetuximab(西妥昔单抗)由德国默克里昂制药公司生产，主要用于治疗结肠直肠癌，商品名为爱必妥，是针对EGF受体的IgG单克隆抗体。它的前身抗体225是通过杂交瘤技术产生的。西妥昔单抗与人EGFR的细胞外结构域结合，竞争性阻断受体与天然配体的结合，如EGF和TGF-α。较高亲和力的西妥昔单抗阻止EGFR形成其开放的活性构象和二聚化，造成EGFR的磷酸化和后续信号级联的蛋白质减少。西妥昔单抗与EGFR特异性结合后，会阻断细胞内信号转导途径，进而抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞的凋亡。目前，在大肠杆菌中成功表达全长IgG抗体的例子有限。2002年，Simmons等人发表在JournalofImmunologicalMethods上的文献Expressionoffull-lengthimmunoglobulinsinEscherichiacoli:rapidandefficientproductionofaglycosylatedantibodies.首次实现了在大肠杆菌中表达全长IgG单克隆抗体，并优化了IgG的轻链和重链的比例，从而获得高产IgG的大肠杆菌工程菌株。2007年，YarvM等人发表在NatureBiotechnology上的文献Isolationofengineered,full-lengthantibodiesfromlibrariesexpressedinEscherichiacoli.公开了构建IgG单抗的组合文库系统，筛选出高产IgG的大肠杆菌突变菌株。分子伴侣是一类蛋白质，它能够识别并结合折叠不完全的蛋白质，帮助多肽的正确转运、折叠。折叠酶和周质空间伴侣蛋白是常见的分子伴侣，它们的共表达可以防止蛋白质的聚集，并提高周质空间中重组蛋白质的表达量。表达抗TNF抗体Fab片段的重组大肠杆菌工程菌这篇中文专利于2016年申请公布，该专利公开了多个分子伴侣如DsbC、PPIB、Skp等分子伴侣对Fab表达的影响。然而，在大肠杆菌中共表达抗EGFR抗体IgG的多种分子伴侣中，哪种分子伴侣最适合，可以最大化提高IgG的表达量并且促进完整IgG的形成，需要大量的实验研究确定。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本实验以E.coliMG1655为出发菌株，提供了一种在大肠杆菌中表达全长IgG抗体的方法，同时共表达了分子伴侣，促进全长IgG的正确形成，提高IgG抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用；所述分子伴侣具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：本专利技术提供了具有DsbA、DsbC和/或Skp的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与DsbA、DsbC和/或Skp表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；IV、如I、II或III所示序列的互补序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体为IgG。在此基础上，本专利技术海提拱了一种表达模块，包括分子伴侣以及单克隆抗体；所述分子伴侣具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有DsbA、DsbC和/或Skp的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与DsbA、DsbC和/或Skp表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；IV、如I、II或III所示序列的互补序列。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体为IgG。本专利技术还提供了所述的表达模块在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本专利技术还提供了表达载体，包括本专利技术所述的表达模块。在此基础上，本专利技术还提供了所述的表达载体在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本专利技术还提供了菌株，包括本专利技术所述的表达载体。在本专利技术的一些具体实施方案中，出发菌株为E.coliMG1655，启动子为Bad。本专利技术还提供了所述的菌株在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。单克隆抗体及其衍生物广泛应用于研究和临床，已被开发为预防、治疗和诊断试剂。本实验以E.coliMG1655为出发菌株，提供了一种在大肠杆菌中表达全长IgG抗体的方法，同时共表达了分子伴侣，促进全长IgG的正确形成，提高IgG抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示大肠杆菌中表达IgG的质粒示意图；图2(A)示DsbA和DsbC作用机理示意图；图2(B)示共表达分子伴侣的质粒示意图；图2(C)示分子伴侣对单克隆抗体表达的影响；图3示图2(C)对应的dsbC的生物统计学结果；其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；P＝0.004<0.01；图4示图2(C)对应的dsbA的生物统计学结果；其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；P＝0.000<0.01；图5示图2(C)对应的skp的生物统计学结果；其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；P＝0.019<0.05。具体实施方式本专利技术公开了分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用；所述分子伴侣具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有DsbA、DsbC和/或Skp的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与DsbA、DsbC和/或Skp表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；IV、如I、II或III所示序列的互补序列。

【技术特征摘要】
1.分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用；所述分子伴侣具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有DsbA、DsbC和/或Skp的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；III、与如I所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与DsbA、DsbC和/或Skp表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；IV、如I、II或III所示序列的互补序列。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述单克隆抗体为IgG。3.表达模块，其特征在于，包括分子伴侣以及单克隆抗体；所述分子伴侣具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：I、具有DsbA、DsbC和/或Skp的核苷酸序列；II、具有如I所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋浩，张金华，赵妍淑，王国平，于振鹏，李以群，叶筱琼，
申请(专利权)人：天津大学，扬州奥锐特药业有限公司，扬州联澳生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12