一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法技术

本发明专利技术公开一种利用蛋白IHF‑α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，通过IHF‑α蛋白与耐热性抗菌肽进行融合基因设计，设计成为含有IHF‑α蛋白与耐热性抗菌肽基因序列的质粒，在大肠杆菌中进行转化和克隆表达得到蛋白后，并对蛋白纯化，最终得到含有耐热性抗菌肽的融合蛋白。本发明专利技术方法将难表达的耐热性抗菌肽利用耐热性的IHF‑α融合表达，使抗菌肽潜在的抑菌性能够得到抑制，使得抗菌肽可以可溶性表达。该方法操作简单，将难表达、小分子量的抗菌肽，通过与耐热性的IHF‑α联合表达，使得耐热性抗菌肽快速简便获得。

A Method of Constructing and Expressing Thermostable Antimicrobial Peptide Fusion Protein by Protein IHF-alpha

The invention discloses a method for constructing and expressing fusion protein of heat-resistant antimicrobial peptide by using protein IHF alpha. The fusion gene is designed by using IHF alpha protein and heat-resistant antimicrobial peptide. The fusion gene is designed as a plasmid containing gene sequence of IHF alpha protein and heat-resistant antimicrobial peptide. After transformation and cloning in E.coli, the protein is obtained and purified, and finally the protein containing heat-resistant antimicrobial peptide is obtained. Fusion protein of thermophilic antimicrobial peptide. The method of the invention utilizes heat-resistant IHF_alpha fusion expression to make the potential bacteriostasis of the heat-resistant antimicrobial peptide be inhibited and the soluble expression of the antimicrobial peptide be made. The method is simple to operate, and the heat-resistant antimicrobial peptide can be obtained quickly and easily by co-expression with heat-resistant IHF_alpha.

【技术实现步骤摘要】
一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法。
技术介绍
抗菌肽属于内源性肽类，是构成先天免疫系统的重要组成部分，通常含有少于50个氨基酸，其中约50％属于疏水性氨基酸，并且抗菌肽绝大多数具有耐热性。抗菌肽具有两个显著的特性，第一，具有广泛的抗菌活性；其次，它们主要针对微生物膜阻碍微生物的生长发育。目前耐药性细菌对动物和人类健康造成了严重威胁，这些多肽因其具有较强的抗菌活性和独特的杀菌机理而受到越来越多的关注，被认为有望成为新型饲料和医药抗生素替代品，因此需要制备大量的高纯度抗菌肽来满足基础研究和临床试验的需要。当前抗菌肽的获得主要有化学合成、直接在自然中分离获取、重组蛋白的三种方法。而化学合成、直接获取抗菌肽的成本太高，也不便于大规模的生成。重组蛋白方法虽易于量产，但这些重组方法多利用昂贵的分离柱纯化，成本较高，在工业规模上目前还不具备生产抗菌肽的能力与条件。另外，现在的融合标签多选择硫氧还蛋白、GST等来构成重组蛋白，而这些标签因蛋白过大，促可溶性表达效果差，给重组蛋白的纯化带来了极大的障碍。宿主整合因子(IntegrationHostFactor，IHF)是一种由α和β亚基组成的杂二聚体蛋白，具有热稳定的性质，IHF-α亚基由himA编码(11.35kD)和，IHF-β亚基由hip编码(10.65kD)。IHF-α是一种耐热的、不结合核酸的蛋白，IHF-β是一种核酸结合的蛋白。将IHF-α与抗菌肽进行融合设计，可以将抗菌肽对宿主菌的致死性隐藏，同时抗菌肽的体积小、阳离子性高，使其极易发生蛋白质降解，融合表达构建了一种有效克服耐热性抗菌肽表达障碍的一种方案。选择IHF-α亚基也避免了IHF中的IHF-β亚基与核酸结合，在表达后的纯化过程也避免了因引入了核酸而添加去除核酸的PEI和PEG高分子化合物，而PEI和PEG有毒。将IHF-α与抗菌肽进行融合设计表达抗菌肽，为今后抗菌肽作为绿色添加剂应用于食品、农业、畜牧业和临床医学提供一种可行方案。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术通过巧妙设计和大量的反复试验，提供一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，该方法可以极大地减少成本，为蛋白重组的大规模工业化提供了一种可能性。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，包括如下步骤：一、表达载体构建：选取耐热性抗菌肽与IHF-α设计融合蛋白，合成后卡入到pET-22b质粒表达载体中，融合蛋白的合成与表达采用常规方法；二、转化克隆、蛋白表达纯化步骤：1)转化对融合蛋白质粒表达载体进行热激法转化：将BL21感受态细胞置于冰上，加入重组质粒，冰上静置30min，置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min，加入LB液体培养基，225rpm，37℃培养1h，取菌液涂布于LB固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养；2)蛋白诱导2).1在LB液体培养基中加千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时；2).2扩培，在LB液体培养基中加入千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，再加入百分之一体积数的过夜培养的菌液，置于37℃、225rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定OD600值为0.6-0.8后，加入诱导剂IPTG诱导，诱导条件为低温16℃、225rpm诱导13小时；3)提取蛋白3).1将诱导过的菌液，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体；3).2离心菌体加入BufferA缓冲溶液充分吹打混匀；3).3离心13000rpm，10min，4℃，保留沉淀；3).4在沉淀中加入BufferA缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解在溶液中；3).5利用超声破碎机在超声强度为20％的条件下，每次间隔5s持续超声破碎5s，直至溶液呈半透明状态；3).6离心13000rpm，4℃，30min后，弃去沉淀保留上清溶液；4)蛋白纯化4).1将上一步获得的上清溶液，加入30％-80％的饱和硫酸铵溶液，充分混匀，随后置于4℃冰箱静置2-6h；4).4将溶液在85℃金属浴中加热，20min；4).5离心13000rpm，4℃，30min，除去不可溶解以及不耐热的蛋白杂质，弃去沉淀，保留上清溶液。进一步，所述耐热性抗菌肽为牛乳铁蛋白肽LfcinB、乳酸链球菌素Nisin、LL-37的衍生肽SAAP-148中的任一种。进一步，所述饱和硫酸铵溶液体积百分数为50％。本专利技术的有益效果：1、本专利技术以IHF-α蛋白作为融合标签，将抗菌肽在大肠杆菌的毒性隐藏，保护抗菌肽免受细胞蛋白酶的侵害，宿主大肠杆菌则免受抗菌肽的侵害。2、本专利技术利用IHF-α蛋白构建重组蛋白不仅可以可融性表达，而且利用IHF-α和抗菌肽的耐热性质也可以简化纯化步骤，相较于其他的可融表达重组蛋白纯化采用的过柱层析以及释放的抗菌肽是通过高效液相色谱(HPLC)进行纯化的方法，本专利技术方法极大地减少了成本，为重组方法的大规模工业化生产提供了一种可能性。3、选择IHF-α亚基也避免了IHF中的IHF-β亚基与核酸结合，在表达后的纯化过程也避免了因引入了核酸而添加去除核酸的PEI和PEG高分子化合物，而PEI和PEG有毒。将IHF-α与抗菌肽进行融合设计表达抗菌肽，为今后抗菌肽作为绿色添加剂应用于食品、农业、畜牧业和临床医学提供一种可行方案。附图说明图1为超声裂解提取IHFα-LfcinB总蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中：M是蛋白Marker；1是未加IPTG诱导的全菌菌液；2是加IPTG诱导的全菌菌液；3是离心后沉淀；4是离心后上清。图2为加不同硫酸铵沉淀纯化IHFα-LfcinB蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白marker；1是加了体积分数40％的硫酸铵；2是加了体积分数50％的硫酸铵；3是加了体积分数60％的硫酸铵；4是加了体积分数70％的硫酸铵；5是加了体积分数80％的硫酸铵。图3为纯化后IHFα-LfcinB蛋白的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白Marker；1是纯化前的蛋白LfcinB-IHFα；2是上清A；3是沉淀A；4是纯化后LfcinB-IHFα蛋白。图4为IHFα-LfcinB蛋白酶切的Tricine-SDS-PAGE电泳图，其中M是蛋白Marker；1是纯化的IHFα-LfcinB；2是LfcinB。图5为纯化后Nisin-IHFα的Tricine-SDS-PAGE电泳图，M是小分子量蛋白Marker；1是加体积分数30％的硫酸铵。图6为纯化后SAAP-148-IHFα的Tricine-SDS-PAGE电泳图，M是小分子量蛋白Marker；1是加体积分数30％的硫酸铵；2是加体积分数40％的硫酸铵。具体实施方式为了达到上述目的与功效，进一步理解本专利技术的技术方案，以下特举出较佳实施例，并配合附图，详细说明如下：以下实施例中所使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。实施例1本实施例选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用蛋白IHF‑α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：一、表达载体构建：选取耐热性抗菌肽与IHF‑α设计融合蛋白，合成后卡入到pET‑22b质粒表达载体中，融合蛋白的合成与表达采用常规方法；二、转化克隆、蛋白表达纯化步骤：1)转化对融合蛋白质粒表达载体进行热激法转化：将BL21感受态细胞置于冰上，加入重组质粒，冰上静置30min，置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min，加入LB液体培养基，225rpm，37℃培养1h，取菌液涂布于LB固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养；2)蛋白诱导2).1在LB液体培养基中加千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时；2).2扩培，在LB液体培养基中加入千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，再加入百分之一体积数的过夜培养的菌液，置于37℃、225rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定OD600值为0.6‑0.8后，加入诱导剂IPTG诱导，诱导条件为低温16℃、225rpm诱导13小时；3)提取蛋白3).1将诱导过的菌液，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体；3).2离心菌体加入Buffer A缓冲溶液充分吹打混匀；3).3离心13000rpm，10min，4℃，保留沉淀；3).4在沉淀中加入Buffer A缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解在溶液中；3).5利用超声破碎机在超声强度为20％的条件下，每次间隔5s持续超声破碎5s，直至溶液呈半透明状态；3).6离心13000rpm，4℃，30min后，弃去沉淀保留上清溶液；4)蛋白纯化4).1将上一步获得的上清溶液，加入30％‑80％的饱和硫酸铵溶液，充分混匀，随后置于4℃冰箱静置2‑6h；4).4将溶液在85℃金属浴中加热，20min；4).5离心13000rpm，4℃，30min，除去不可溶解以及不耐热的蛋白杂质，弃去沉淀，保留上清溶液。...

【技术特征摘要】
1.一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：一、表达载体构建：选取耐热性抗菌肽与IHF-α设计融合蛋白，合成后卡入到pET-22b质粒表达载体中，融合蛋白的合成与表达采用常规方法；二、转化克隆、蛋白表达纯化步骤：1)转化对融合蛋白质粒表达载体进行热激法转化：将BL21感受态细胞置于冰上，加入重组质粒，冰上静置30min，置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min，加入LB液体培养基，225rpm，37℃培养1h，取菌液涂布于LB固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养；2)蛋白诱导2).1在LB液体培养基中加千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时；2).2扩培，在LB液体培养基中加入千分之一体积数的100μg/mL氨苄西林Amp，再加入百分之一体积数的过夜培养的菌液，置于37℃、225rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定OD600值为0.6-0.8后，加入诱导剂IPTG诱导，诱导条件为低温16℃、225rpm诱导13小时；3)提取蛋白3).1将诱导过的菌液，离心13000r...

【专利技术属性】
技术研发人员：戚智青，徐蕾，郑晨娜，张云威，刁勇，盛晓菁，杜明，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建,35