The invention discloses a method for preparing P2X7R immunogen, optimizing the amino acid sequence of the extracellular segment of P2X7R protein, using full gene synthesis, inserting the coding sequence of the extracellular segment of P2X7R gene into the expression vector pET30a through restriction enzyme digestion sites NdeI and HindIII, and confirming the accuracy of the final expression vector by enzyme digestion and sequencing. The recombinant plasmid encoding sequence protein was transformed into BL21 expression strain and induced by IPTG. The P2X7R protein was purified by affinity chromatography and detected. The beneficial effect of the present invention is that the immunogenic extracellular segment of P2X7R can be obtained and used for the preparation of P2X7R antibody.
【技术实现步骤摘要】
一种制备P2X7R免疫原的方法
本专利技术属于制药
，涉及人类嘌呤能离子通道型受体7(purinergicligand-gatedionchannel7receptor,P2X7R)的胞外段免疫原制备、纯化及鉴定。
技术介绍
在细胞损伤、缺氧或炎症状态时，体内多种细胞释放大量ATP，进入细胞外间隙的ATP及其分解产物ADP和AMP作用于P2受体。P2受体包括离子通道型P2X受体(P2X1～7)和代谢型G-蛋白偶联P2Y受体(P2Y1/2/4/6/11/12/13/14)，其中ATP/P2X7R信号通路参与诱导炎性细胞因子分泌，与炎症发生发展密切相关。T淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、肥大细胞等多种免疫细胞上均可检测到P2X7R的表达。不同细胞利用ATP/P2X7受体通路发挥不同的功能。在多种自身免疫性疾病的研究中已证实ATP/P2X7受体信号通路对病程、病情的调控作用。P2X7R亚基的胞外环上有ATP结合位点，胞内含有一个短链N端和一个长链C端，C端为P2X7R受体的主要功能结构域。N端的结构序列高度保守，由395个氨基酸残基组成，与P2X7R受体家族其它亚...
【技术保护点】
1.一种制备P2X7R免疫原的方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；步骤2：将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21表达菌株中并进行IPTG诱导表达，将含有重组质粒的BL21菌种接种到4mL的LB培养基中，待培养至OD600为0.5‑0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mM IPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达，取诱导后的培养液...
【技术特征摘要】
1.一种制备P2X7R免疫原的方法，其特征在于按照以下步骤进行：步骤1：对P2X7R蛋白胞外段氨基酸序列进行优化，采用全基因合成并通过限制性酶切位点NdeI和HindIII将P2X7R胞外段基因编码序列插入到表达载体pET30a中，并通过酶切法和测序确认最终表达载体的准确性；步骤2：将构建好的含有P2X7R胞外段基因编码序列蛋白表达重组质粒转化到BL21表达菌株中并进行IPTG诱导表达，将含有重组质粒的BL21菌种接种到4mL的LB培养基中，待培养至OD600为0.5-0.8，向试管培养液中加入终浓度0.2mMIPTG，之后分别置于15℃、37℃诱导表达，取诱导后的培养液12000rpm离心5min，去除上清液，加入PBS液重悬沉淀，最后加入SDS-PAGE上样缓冲液于100℃下加热样品10min，然后离心取上清电泳，电泳后取出凝胶用考马斯亮蓝染色液染色，...
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