一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种LDLR‑Lamp2b融合基因、表达载体及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明专利技术所述LDLR‑Lamp2b融合基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术将LDLR胞外段和Lamp2b的全长以独特的方式融合作为一个完整的基因，该基因经表达载体转染外泌体包装细胞后，可以将LDLR呈现在外泌体表面，所述外泌体可以携带LDL进入肝脏等组织的细胞，促进LDL的清除，发挥类似于甚至优于PCSK9抑制剂的效果，可用于动脉粥样硬化的防治。

A LDLR-Lamp2b Fusion Gene, Expression Vector and Its Application

The invention provides a LDLR Lamp2b fusion gene, expression vector and application, which relates to the field of genetic engineering technology. The LDLR Lamp2b fusion gene of the invention has a nucleotide sequence as shown in SEQ ID NO.1. The full length of the extracellular segment of LDLR and Lamp2b is fused as a complete gene in a unique way. After the gene is transfected into exosome packaging cells by an expression vector, LDLR can be displayed on the surface of the exosome. The exosome can carry LDL into the cells of liver and other tissues, promote the removal of LDL, play a similar or even better effect than PCSK9 inhibitor, and can be used in atherosclerosis. Prevention and treatment of sclerosis.

【技术实现步骤摘要】
一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用。
技术介绍
心血管疾病位列当前威胁人类健康的三大疾病，即心血管疾病、肿瘤和传染性疾病之首，而动脉粥样硬化又是心血管疾病的最重要的病理学基础之一，是引起心肌梗塞、脑梗塞以及冠心病等心脑血管疾病死亡的主要原因，与许多疾病的发生发展都有关系。防治动脉粥样硬化是防治心血管疾病的根本性措施。动脉粥样硬化的预防分两级：一级预防，是饮食清淡、不吸烟、不饮烈酒，情志舒畅等；二级预防则是终生使用阿司匹林抗栓，他汀类调脂。其中，阿司匹林对胃肠道的刺激众所周知，长期使用易致胃黏膜损伤，引起胃溃疡及胃出血，而他汀类药物引发2型糖尿病风险高达46％。同时，常规用药并没有真正针对LDL-c升高和HDL-c降低的原因，而只是简单直接的降低胆固醇的合成。LDLR是清除LDL的重要分子，通过识别LDL促进其进入细胞和利用。内源PCSK9还可以竞争性抑制LDLR，导致LDL清除不及时，是动脉粥样硬化发生发展的重要机制。如何增强LDLR清除LDL的能力，同时阻断PCSK9对其的抑制，有望改善机体LDL水平，降低动脉粥样硬化发生率，是亟待解决的技术难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用，该载体转染外泌体包装细胞后，产生的外泌体可以携带血管内的LDL进入细胞，促进其利用，同时进入细胞的外泌体，其LDLR成分还可以抑制PCSK9的表达和分泌，进一步促进LDL的清除。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种LDLR-Lamp2b融合基因，所述LDLR-Lamp2b融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。优选的，所述LDLR-Lamp2b融合基因的结构为：Lamp2b的N端-LDLR胞外段-Lamp2b的C端；所述LDLR胞外段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述Lamp2b的N端核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述Lamp2b的C端核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术提供了一种表达上述LDLR-Lamp2b融合基因的表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b，所述LDLR-Lamp2b融合基因在Nhe1和BamH1克隆位点处插入载体pcDNA3.1(-)中。本专利技术提供了表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b的构建方法，包括以下步骤：1)提取小鼠肌肉组织总RNA，反转录得到cDNA；2)以步骤1)得到的所述cDNA为模板，扩增Lamp2b的N端和Lamp2b的C端，得Lamp2b5和Lamp2b3序列；3)将步骤2)得到的所述Lamp2b5利用限制性内切酶Nhe1和Xho1克隆至pcDNA3.1(-)载体得pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体；4)将步骤2)得到的所述Lamp2b3利用限制性内切酶Xho1和BamH1克隆至步骤3)得到的所述pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体上，得pcDNA3.1(-)-Lamp2b载体；5)通过限制性内切酶Xho1和BspE将LDLR的序列克隆至步骤4)得到的所述pcDNA3.1(-)-Lamp2b载体上，得表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b。优选的，步骤2)所述扩增Lamp2b的N端用引物序列如SEQIDNO.5～SEQIDNO.6所示；所述扩增Lamp2b的C端用引物序列如SEQIDNO.7～SEQIDNO.8所示。优选的，步骤2)所述扩增的程序为：95℃预变性3min；95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸30s～2min，30个循环。本专利技术还提供了上述LDLR-Lamp2b融合基因或利用上述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b或利用上述构建方法构建得到的表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b在制备治疗和/或预防动脉粥样硬化药物中的应用。优选的，所述药物的有效成分包括：所述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b转染外泌体包装细胞后生产得到的外泌体。优选的，所述外泌体的制备方法包括：将所述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b转染外泌体包装细胞AML12，转染后经10％血清DMEM培养液培养12h，更换为无血清培养基继续培养，收集外泌体。优选的，所述收集为收集在所述无血清培养基上培养48～72h之间的细胞产生的外泌体。本专利技术提供了一种LDLR-Lamp2b融合基因、表达载体及其应用，将LDLR胞外段和Lamp2b的全长融合作为一个完整的基因，该基因经表达载体转染外泌体包装细胞后，可以将LDLR呈现在外泌体表面，所述外泌体可以携带LDL进入肝脏等脏器，促进LDL的清除，发挥类似于甚至优于PCSK9抑制剂的效果，可用于动脉粥样硬化的防治。附图说明图1为载体构建图；图2为WB检测和IP实验结果图；图3为外泌体效果图。具体实施方式本专利技术提供了一种LDLR-Lamp2b融合基因，所述LDLR-Lamp2b融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术中，所述LDLR-Lamp2b融合基因的结构优选为：Lamp2b的N端-LDLR胞外段-Lamp2b的C端；所述LDLR胞外段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述Lamp2b的N端核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述Lamp2b的C端核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。本专利技术提供了一种表达上述LDLR-Lamp2b融合基因的表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b。本专利技术所述表达载体的结构如图1所示：，将所述LDLR-Lamp2b融合基因在Nhe1和BamH1克隆位点处插入载体pcDNA3.1(-)中。本专利技术还提供了上述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b的构建方法，包括以下步骤：1)提取小鼠肌肉组织总RNA，反转录得到cDNA；2)以步骤1)得到的所述cDNA为模板，扩增Lamp2b的N端和Lamp2b的C端，得Lamp2b5和Lamp2b3序列；3)将步骤2)得到的所述Lamp2b5利用限制性内切酶Nhe1和Xho1克隆至pcDNA3.1(-)载体得pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体；4)将步骤2)得到的所述Lamp2b3利用限制性内切酶Xho1和BamH1克隆至步骤3)得到的所述pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体上，得pcDNA3.1(-)-Lamp2b载体；5)通过限制性内切酶Xho1和BspE将LDLR的序列克隆至步骤4)得到的所述pcDNA3.1(-)-Lamp2b载体上，得pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b载体。在本专利技术所述表达载体的构建方法中，提取小鼠肌肉组织总RNA，反转录后得到cDNA。本专利技术所述小鼠肌肉组织优选为小鼠成纤维细胞。本专利技术对所述RNA的提取方法并没有特殊限定，优选为Trizol法。本专利技术对所述反转录的方法并没有特殊限定，优选利用PromegaM-MLV反转录酶对RNA进行反转录，得小鼠成纤维细胞cDNA。本专利技术所述反转录的反应体系优选为20μL体系，包括：RNA模板2μg，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LDLR‑Lamp2b融合基因，所述LDLR‑Lamp2b融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种LDLR-Lamp2b融合基因，所述LDLR-Lamp2b融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述LDLR-Lamp2b融合基因，其特征在于，所述LDLR-Lamp2b融合基因的结构为：Lamp2b的N端-LDLR胞外段-Lamp2b的C端；所述LDLR胞外段的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述Lamp2b的N端核苷酸序列如SEQIDNO.3所示，所述Lamp2b的C端核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。3.一种表达权利要求1或2所述LDLR-Lamp2b融合基因的表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b，其特征在于，所述LDLR-Lamp2b融合基因在Nhe1和BamH1克隆位点处插入载体pcDNA3.1(-)中。4.一种权利要求3所述表达载体pcDNA3.1(-)-LDLR-Lamp2b的构建方法，包括以下步骤：1)提取小鼠肌肉组织总RNA，反转录得到cDNA；2)以步骤1)得到的所述cDNA为模板，扩增Lamp2b的N端和Lamp2b的C端，得Lamp2b5和Lamp2b3序列；3)将步骤2)得到的所述Lamp2b5利用限制性内切酶Nhe1和Xho1克隆至pcDNA3.1(-)载体得pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体；4)将步骤2)得到的所述Lamp2b3利用限制性内切酶Xho1和BamH1克隆至步骤3)得到的所述pcDNA3.1(-)-Lamp2b5载体上，得pcDNA3.1(-)-Lamp2b载体；5)通过限制性内切酶Xho1和B...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁丽君，李者龙，杨薛康，赵联璧，邢长洋，杨国栋，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61