本发明专利技术公开了一种鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒及其应用。所述病毒样颗粒由SEQ ID NO.15所示的融合基因和禽流感病毒H3N2 M1基因共表达得到。本发明专利技术利用杆状病毒/昆虫细胞表达系统研制得到表达鸭坦布苏病毒（DTMUV）E蛋白的嵌合病毒样颗粒，具有显著的免疫效果，为开发鸭坦布苏病毒新型疫苗和多价疫苗奠定了理论和实践基础。同时，本发明专利技术制备得到的病毒样颗粒不含有病毒核酸，因而不具有复制能力，也不会引起鸭坦布苏病毒感染，可以最大程度地降低疫苗使用的风险，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒及其应用
本专利技术涉及鸭坦布苏病毒
，更具体地，涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒及其应用。
技术介绍
鸭坦布苏病毒病是近年来在我国新爆发并广泛流行的传染性疾病，可造成感染鸭群采食量和产蛋量急速下降，并可感染其它家禽，给养禽业造成巨大经济损失。目前，该病的防控有商品化灭活疫苗，但生产中仍时常有鸭坦布苏病毒病暴发，还处于研发阶段的疫苗有存在病毒滴度不高，抗原含量不足等问题。因此，该病的有效防控亟待新型疫苗的研发。病毒样颗粒(VLPs)是指含有病毒的一个或者几个结构蛋白的空心颗粒。目前，一些病毒的VLPs已作为疫苗成功应用于临床，如：人乳头瘤病毒(HPV)四价VLPs疫苗、乙型肝炎病毒(HBV)等。随着对VLPs越来越深入的研究，含有来自两种病毒的结构蛋白的嵌合VLPs成为了VLPs在应用上一个非常重要且有发展前途的方向。目前尚无鸭坦布苏病毒病嵌合VLPs疫苗的研究报道。多种亚型的流感病毒，包括H5N1，H3N2，H1N1，H9N2等已被用于VLPs的包装，并取得成功。最新研究表明单HA蛋白和M1蛋白就能够成功包装出流感VLPs。与同属于A型流感病毒的其它所有17种亚型流感病毒HA蛋白的跨膜区(TM)相比较，H3亚型流感病毒HA蛋白的跨膜区具有独特的结构，有助于HA蛋白形成分子间二硫键，提高HA蛋白的稳定性和蛋白的免疫原性。本研究包装出以流感病毒H3N2VLPs为骨架的，表面展示鸭坦布苏病毒主要免疫保护蛋白E的嵌合VLPs，并将经过纯化的嵌合VLPs进行动物免疫以评价其免疫保护效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒的制备及应用。本专利技术的第一个目的是提供一种融合基因。本专利技术的第二个目的是提供一种融合蛋白。本专利技术的第三个目的是提供一种载体。本专利技术的第四个目的是提供一种载体组合。本专利技术的第五个目的是提供一种杆状病毒。本专利技术的第六个目的是提供一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒。本专利技术的第七个目的是提供以上所述融合基因、以上所述融合蛋白、以上所述载体、以上所述载体组合或以上所述杆状病毒在制备鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒中的应用。本专利技术的第八个目的是提供以上所述融合基因、以上所述融合蛋白、以上所述载体、以上所述载体组合、以上所述杆状病毒或以上所述嵌合病毒样颗粒在制备鸭坦布苏病毒疫苗中的应用。本专利技术的第九个目的是提供一种鸭坦布苏病毒疫苗。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：本专利技术制备了一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒，以其制备的鸭坦布苏病毒疫苗有很好的免疫保护效果，因此本专利技术要求保护以下内容：一种融合基因，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。一种融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示。一种重组载体，所述载体含有以上所述融合基因和禽流感病毒H3N2的M1基因，并分别位于载体的两个开放阅读框。一个重组载体组合，包括重组载体1和重组载体2，重组载体1含有以上所述融合基因，重组载体2含有禽流感病毒H3N2的M1基因。优选的，所述载体为pFastBacDual。禽流感病毒H3N2的M1基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.18所示。一个重组的杆状病毒，所述杆状病毒含有以上所述融合基因和禽流感病毒H3N2的M1基因。一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒，所述病毒是通过使用以上所述融合基因、以上所述融合蛋白、以上所述载体、以上所述载体组合、或以上所述杆状病毒制备的。优选地，所述嵌合病毒样颗粒是从上述细胞的培养液中分离纯化得到的。一种表达鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：S1.得到核苷酸序列如SEQIDNO.15所示的融合基因和流感病毒H3N2M1基因；S2.将上述两个基因分别连接入病毒表达转移载体的两个开放阅读框，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选得到重组转移载体，转化DH10Bac感受态细胞，筛选得到重组穿梭质粒，并转染细胞；S3.培养被转染的细胞，收集细胞上清，获得重组病毒并进行传代；S4.获得重组病毒感染细胞，获得并纯化病毒样颗粒。优选地，步骤S2中，病毒表达转移载体为杆状病毒表达转移载体。更优选地，步骤S2中，病毒表达转移载体为pFastBacDual杆状病毒表达转移载体。优选地，步骤S2中，转染昆虫细胞。更优选地，步骤S2中，转染昆虫细胞Sf9。优选地，步骤S3中，培养被转染的细胞的时间为：当细胞出现典型细胞病变时或25～30℃，培养70～75h。细胞出现典型细胞病变时的表现为：细胞变大，变圆，细胞核增大，胞内折光性强的物质明显增大，细胞生长缓慢甚至停止，培养基中出现较多悬浮细胞。优选地，步骤S3中，培养被转染的细胞的时间为27℃，培养72h。优选地，步骤S4中，纯化病毒样颗粒的具体方法为：取细胞上清液，8,000～12,000rpm离心8～12min，取上清；35,000～45,000rpm离心100～140min，取沉淀用PBS(pH7.4)缓冲液重悬；将重悬液利用已形成梯度的20％～60％的蔗糖梯度液进行离心，25,000～30,000rpm水平转头离心100～140min；分离病毒样颗粒条带，PBS缓冲液重悬后，35,000～45,000rpm超速离心100～140min，弃上清；适量PBS重悬沉淀保存。最优选地，表达鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：S1.得到核苷酸序列如SEQIDNO.15所示的融合基因和流感病毒H3N2M1基因；S2.将上述两个基因分别连接入pFastBacDual杆状病毒表达转移载体，转化DH10Bac感受态细胞，经筛选得到重组杆状病毒穿梭载体，重组杆状病毒穿梭载体转染昆虫细胞Sf9；S3.27℃培养被转染的细胞72h，收集细胞上清，获得重组病毒并进行传代；S4.获得重组病毒，以MOI等于5感染细胞，取细胞上清液，10,000rpm离心10min，取上清；40,000rpm离心2h，取沉淀用PBS缓冲液重悬；将重悬液利用已形成梯度的20％～60％的蔗糖梯度液，27,000rpm水平转头离心2h；分离病毒样颗粒条带，PBS缓冲液重悬后，40,000rpm超速离心2h，弃上清；适量PBS重悬沉淀保存。以上所述融合基因、以上所述融合蛋白、以上所述载体、以上所述载体组合或以上所述杆状病毒在制备鸭坦布苏病毒E基因的嵌合病毒样颗粒中的应用。以上所述融合基因、以上所述融合蛋白、以上所述载体、以上所述载体组合、以上所述杆状病毒或以上所述嵌合病毒样颗粒在制备鸭坦布苏病毒疫苗中的应用。一种鸭坦布苏病毒疫苗，包括以上所述表达鸭坦布苏病毒E基因的嵌合病毒样颗粒。一种上述鸭坦布苏病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1.用以上所述表达鸭坦布苏病毒E蛋白的嵌合病毒样颗粒与土温-80配置水相；S2.矿物油、司本-80和硬脂酸铝配置油相，灭菌；S2.水相和油相按照1:1.5～1:2的比例配制并充分乳化。优选地，E蛋白的嵌合病毒样颗粒与土温-80的体积比为90～95：5～10。更优选地，E蛋白的嵌合病毒样颗粒与土温-80的体积比本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。
【技术特征摘要】
1.一种融合基因，其特征在于，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示。2.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合基因的氨基酸序列如SEQIDNO.16所示。3.一种重组载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述融合基因和禽流感病毒H3N2的M1基因，并分别位于载体的两个开放阅读框。4.一种重组载体组合，其特征在于，包括重组载体1和重组载体2，重组载体1含有权利要求1所述融合基因，重组载体2含有禽流感病毒H3N2的M1基因。5.一种重组的杆状病毒，其特征在于，所述杆状病毒含有权利要求1所述融合基因和禽流感病毒H3N2的M1基因。6.权利要求1所述融合基因、权利要求2所述融合蛋白、权...
【专利技术属性】
技术研发人员：李林林，孙敏华，董嘉文，张俊勤，张春红，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物卫生研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44
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