一种可诱导凋亡的携带检测标签的CD20嵌合抗原受体T淋巴细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种编码表达于人淋巴细胞表面的CD20嵌合抗原受体和标签融合蛋白的核酸，所述嵌合抗原受体蛋白包含顺序连接的胞外结合区，跨膜区和胞内信号区以及可用于跟踪检测CAR‑T细胞的标签蛋白，其中所述胞外结合区包含特异性识别CD20胞外区的单链抗体scFv(CD20)；该核酸同时编码表达于人淋巴细胞胞内的可诱导细胞凋亡的蛋白的核酸，可随时诱导嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞凋亡，消除免疫治疗后的副作用。本发明专利技术还提供一种采用上述核酸表达的蛋白修饰的T淋巴细胞，其表面表达一种可直接检测的嵌合抗原受体，胞内表达可诱导细胞凋亡的蛋白。

A CD20 chimeric antigen receptor T lymphocyte with detection tag that can induce apoptosis and its application

The present invention provides a nucleic acid encoding CD20 chimeric antigen receptor and label fusion protein expressed on human lymphocyte surface. The chimeric antigen receptor protein includes sequentially connected extracellular binding region, transmembrane region and intracellular signal region, and label protein for tracking and detecting CAR T cells. The extracellular binding region contains scFv, a single chain antibody specifically recognizing CD20 extracellular region. (CD20); The nucleic acid encodes the nucleic acid of apoptotic protein expressed in human lymphocyte cells, which can induce apoptosis of T lymphocyte modified by chimeric antigen receptor at any time and eliminate the side effects of immunotherapy. The invention also provides a T lymphocyte modified with the protein expressed by the nucleic acid, which expresses a chimeric antigen receptor directly detectable on its surface and a protein expressed in the cell that can induce apoptosis.

【技术实现步骤摘要】
一种可诱导凋亡的携带检测标签的CD20嵌合抗原受体T淋巴细胞及其应用
本专利技术涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于CD20的可诱导凋亡并简便检测的嵌合抗原受体及其应用，具体地涉及对特异性表达CD20的B细胞来源的肿瘤的可诱导凋亡并可检测嵌合抗原受体表达的转基因淋巴细胞的制备及治疗应用。
技术介绍
嵌合抗原受体是由抗原识别结构域(配体或单链抗体)和胞内的一系列信号结构域依次连接而成，具体包括抗原特异性的受体(如单链抗体scFv)，间隔序列(spacer)，跨膜序列(TMDomain)和胞内共刺激信号分子。在体内CAR修饰的T淋巴细胞能够通过其单链抗体特异的识别相关肿瘤表面抗原，然后通过胞内共刺激信号分子将识别的信号传递到细胞内，激活细胞的杀伤性，靶向杀伤肿瘤细胞。由于CAR-T细胞在血液肿瘤的免疫治疗中起到了重要作用，以CD19-CAR-T细胞治疗淋巴细胞肿瘤最为突出，2017年美国FDA已经批准上市。淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意。近年来，CAR-T淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略。根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(TCellReceptor,TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的单链抗体scFv(single-chainFv，scFv)和T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式表达在T淋巴细胞表面。这种CAR-T淋巴细胞能够以主要相容性复合物(MajorHistocompatibilityComplex,MHC)非限制性方式选择性的将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。表达嵌合性抗原受体的T淋巴细胞通过scFv与靶细胞抗原结合后，胞内信号转导区将信号传入T细胞，从而激活T细胞，分泌穿孔素、颗粒酶及细胞因子等而发挥杀伤作用。嵌合抗原受体包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区(intracellularsignalregion，ISR)。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8、CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ，及共刺激信号分子CD28、4-1BB(CD137)、OX40(CD134)等分子的胞内信号区。目前CAR技术已经发展到四代，几代CAR-T的区别在于细胞内信号转到区连入了不同的增强共刺激信号。第一代CAR只含有一个胞内的信号分子为CD3ζ或FcεRIγ。第二代CAR增加了一个协同共刺激因子；第三代CAR含有两个协同共刺激因子；而第四代CAR引入细胞因子、自杀基因等。尽管一些临床前实验证明第3代CAR在T细胞的扩增倍数、体内存活时间以及分泌细胞因子的能力都较第2代有优势，但由于第3代CAR技术用于临床仍然存在一定的风险，目前用于临床试验的主要是第2代CAR技术。CD20单克隆抗体疗法在治疗B细胞淋巴瘤中已取得了令人满意的效果，但是很多患者最终会产生耐药性。CD20分子是一种B细胞分化抗原，仅表达于前B细胞和成熟B细胞表面，表达于95％以上的B细胞性淋巴瘤，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达。重要的是，CD20分子在膜上比较暴露，容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也不会因为与抗体的结合而发生抗原调变，故成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种编码表达于T淋巴细胞表面的CD20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，该核酸表达的嵌合抗原受体蛋白使得表达该受体的淋巴细胞针对高表达CD20的肿瘤细胞具有高度特异性的细胞毒性作用。本专利技术的第二个目的在于提供包括上述编码表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸载体。本专利技术的第三个目的在于提供一种包含上述载体的病毒。本专利技术的第四个目的在于提供一种可检测的CD20特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。本专利技术的第五个目的在于提供一种可诱导凋亡的CAR-T淋巴细胞的应用。为了实现上述目的，本专利技术提供一种编码表达于T淋巴细胞表面的CD20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，该核酸序列如SeqIDNo.8所示。其中，该核酸编码表达的CD20特异性嵌合抗原受体包含顺序连接的胞外结合区，CD8α铰链区、跨膜区和CD28、CD137、CD3ζ胞内信号区以及可用于检测的V5-Tag，其中所述胞外结合区包含特异性识别CD20的单链抗体scFv(CD20)。其中，该核酸编码表达的CD20特异性嵌合抗原受体包含scFv(CD20)-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ及其组合，该组合优选为：scFv(CD20)-CD8α-CD137-CD3ζ或scFv(CD20)-CD8α-CD28-CD3ζ。其中，该标签融合蛋白选自V5-Tag、6Xhis-Tag、S-Tag、Flag-Tag、Myc-Tag或HA-Tag。其中，该核酸编码表达的标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因通过IRES序列连接。其中，该核酸编码表达的可诱导凋亡的基因为FKBP12(F36V)-Caspase9。本专利技术还提供一种核酸载体，该核酸载体为包含有上述核酸的真核表达载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体或转座子。本专利技术还提供一种病毒，该病毒为包含有上述核酸载体的病毒。其中，该病毒为包含scFv(CD20)-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ-V5-IRES-FKBP12(F36V)-Caspase9序列的重组载体的腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒。本专利技术还提供一种可检测的CD20特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，包含有上述的核酸，或上述的核酸载体，或上述的病毒。本专利技术还提供一种如上述T淋巴细胞作为制备CAR-T免疫治疗的药物的应用。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的一种编码表达于T淋巴细胞表面的CD20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸、核酸载体、病毒及可检测的CD20特异性嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞，通过将第二代CAR结构改进为第三代CAR结构，使得杀伤效果更强；选用跟靶抗原的亲和力更高的单链抗体；增加了可用于分析、检测CAR-T细胞的标签；增加了可诱导凋亡的安全开关序列，使CAR-T免疫治疗更加安全。附图说明图1为本专利技术所述的嵌合抗原受体慢病毒表达质粒的结构示意图图2A至图2D为流式细胞术对分离培养的NKT细胞表型分析结果。图3为流式细胞术检测嵌合抗原受体慢病毒CAR-CD20-8213V5-iCasp9对NKT细胞的感染效率。图4A至图4D为流式细胞术对嵌合抗原受体CAR-CD20-8213V5-iCasp9修饰的NKT细胞表型鉴定结果。图5为RT-PCR检测嵌合抗原受体基因CAR-CD20-8213V5-iCasp9在NKT细胞中的表达。图6为WesternBlot检测嵌合抗原受体CAR-CD20-8213V5-iCasp9在NKT细胞内的表达。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种编码表达于T淋巴细胞表面的CD20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，其特征在于：该核酸序列如Seq ID No.8所示。

【技术特征摘要】
1.一种编码表达于T淋巴细胞表面的CD20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，其特征在于：该核酸序列如SeqIDNo.8所示。2.如权利要求1所述的编码表达于T淋巴细胞表面的CD20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，其特征在于：该核酸编码表达的CD20特异性嵌合抗原受体包含顺序连接的胞外结合区，CD8α铰链区、跨膜区和CD28、CD137、CD3ζ胞内信号区以及可用于检测的V5-Tag，其中所述胞外结合区包含特异性识别CD20的单链抗体scFv(CD20)。3.如权利要求2所述的编码表达于T淋巴细胞表面的CD20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，其特征在于：该核酸编码表达的CD20特异性嵌合抗原受体包含scFv(CD20)-CD8α-CD28-CD137-CD3ζ及其组合，该组合优选为scFv(CD20)-CD8α-CD137-CD3ζ或scFv(CD20)-CD8α-CD28-CD3ζ。4.如权利要求1所述的编码表达于T淋巴细胞表面的CD20特异性嵌合抗原受体、标签融合蛋白和可诱导凋亡的基因的核酸，其特征在于：该标签融合蛋白选自V5-Tag、6Xhis-Tag、S-Tag、Flag-Tag、...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩庆旺，
申请(专利权)人：河北璋达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河北,13