本发明专利技术公开了一种ACTA2‑MITF融合基因及其检测引物和应用。ACTA2‑MITF基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间；ACTA2基因位于ACTA2基因位于10q23.31，所述的融合基因包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。检测ACTA2‑MITF易位性肿瘤的PCR引物，由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2组成。ACTA2‑MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2‑MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。本发明专利技术针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的PCR引物，扩大了原有检测手段的检测范围，应用于临床，可提高诊断MiT家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。
【技术实现步骤摘要】
一种ACTA2-MITF融合基因及其检测引物和应用
本专利技术属于医学检验领域，涉及一种ACTA2-MITF融合基因及其检测引物和应用。
技术介绍
小眼畸形转录因子家族(microphthalmia-associatedtranscriptionfactorfamily，MiT)包括了小眼畸形转录因子(MiTF)、TFE3、TFEB和TFEC基因。目前已经发现了Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾细胞癌和t(6；11)(p21；q12)易位/TFEB基因融合相关性肾细胞癌，这两类肿瘤已被2016版新版WHO肾脏肿瘤病理收录，并且一并归入MiT家族易位性肾细胞癌中。近期本研究团队利用高通量测序技术成功诊断出一例PRCC-MITF易位性肾细胞癌，这也填补了MiT家族易位性肾细胞中MiTF易位类型的空白。目前MITF易位性肾癌包括PRCC-MITF和CLTC-MITF两种基因易位模式。TFEC基因易位的肿瘤在世界范围内暂无文献报道。MiT家族易位性肾细胞癌致病机理清晰明确，MiT家族成员基因(TFE3/TFEB)的易位是其关键致病因素：这类肿瘤均涉及MiT家族成员基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达TFE3/TFEB融合蛋白，而TFE3/TFEB作为一个转录因子，通过与特异的DNA结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有10种不同的易位伴侣和融合基因被报道，包括ASPL-TFE3、PRCC-TFE3、SFPQ-TFE3、NONO-TFE3、CLTC-TFE3、LUC7L3-TFE3、KHSRP-TFE3、PARP14-TFE3、DVL2-TFE3、RBM10-TFE3和MALAT1-TFEB等，每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。此外，越来越多的TFE3相关的间叶源性肿瘤被报道，如伴有TFE3基因重排的血管周上皮样细胞肿瘤(perivascularepithelioidcelltumor，PEComa)，该肿瘤与不伴有TFE3基因重排的PEComa相比具有更加侵袭性的生物学行为，患者多出现肿瘤复发、转移或死亡。研究发现SFPQ-TFE3融合基因是其最常见的融合基因，偶尔也可见其他融合基因，如NONO-TFE3、DVL2-TFE3及MED15-TFE3。有证据表明哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)信号通路在多种MiT基因相关性肿瘤中被激活。MiT基因家族接受mTOR信号通路的调控。随着肿瘤个体化及靶向治疗时代的到来，针对mTOR等基因靶向治疗成为MiT基因家族易位相关性肿瘤患者新的选择。因此，精确诊断此类肿瘤显得十分重要。本专利技术科研团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合血管周上皮样细胞肿瘤(PEComa)特征的病例中检测出ACTA2-MITF融合基因，该融合基因型为首次发现，国内外均无报道，且这是国际首次发现MITF基因易位相关性PEComa。目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的PCR引物组合，对肿瘤组织中提取出的RNA逆转录之后进行PCR扩增并测序，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计PCR引物将有利于MiT基因家族易位相关的PEComa检测准确度的进一步提高。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种MITF的新易位伴侣：ACTA2-MITF融合基因。本专利技术的另一目的是提供该ACTA2-MITF融合基因的检测引物。本专利技术的又一目的是提供引物的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：一种ACTA2-MITF融合基因,为MITF的新易位伴侣，基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间；ACTA2基因位于10q23.31(10号染色体，位置88935074-88991397，序列来自GeneBank，序列版本号GRCh38.p12)，共10个外显子；所述的新融合基因优选包含SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。我们通过高通量测序方法检测未知融合基因的PEComa肿瘤患者的标本，发现所述的MITF的新基因易位。本专利技术ACTA2-MITF基因易位，这一位点国内外文献均未报道过，原有MITF融合基因扩增引物也无法检测出这一融合基因，因此会导致漏诊。本专利技术所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂优选检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物。所述的检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物进一步优选为：ACTA2-E2-F2：SEQIDNO.1；MITF-E3-R4：SEQIDNO.2。一种检测ACTA2-MITF易位性肿瘤的PCR引物，为检测本专利技术所述的ACTA2-MITF融合基因的PCR引物。所有能够检测本专利技术所述ACTA2-MITF融合基因的引物对均在本专利技术的保护范围内。针对本专利技术找到的新的融合基因，我们在ACTA2的2号外显子和MITF的3号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cDNA的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物GC含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本RNA碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在300bp以下。经过多次调试和验证，最终设计的引物序列为：ACTA2-E2-F2：GCTATGTGTGAAGAAGAGGAC(SEQIDNO.1)；MITF-E3-R4：AAGTGGTAGAAAGGTACTGCT(SEQIDNO.2)，理论扩增产物长217bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：GCTATGTGTGAAGAAGAGGACAGCACTGCCTTGGTGTGTGACAATGGCTCTGGGCTCTGTAAGGCCGGCTTTGCTGGGGACGATGCTCCCAGGGCTGTTTTCCCATCCATTGTGGGACGTCCCAGACATCAGGTGCAGACCCACCTCGAAAACCCCACCAAGTACCACATACAGCAAGCCCAACGGCAGCAGGTAAAGCAGTACCTTTCTACCACTT(SEQIDNO.3)。经实验验证，该引物可成功扩增出目的条带，条带单一、特异。一种ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂盒，包括本专利技术所述的PCR引物。有益效果：本专利技术针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的PCR引物，扩大了原有检测手段的检测范围，应用于临床，可提高诊断MiT家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为三个工作日。采用本专利技术提供的引物组合进行检测PRCC-MITF易位性肿瘤，不但方便、快速本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种ACTA2‑MITF融合基因，其特征在于基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间；其中，ACTA2基因位于10号染色体，位置88935074‑88991397，在GeneBank中的序列版本号为GRCh38.p12，共10个外显子，所述的融合基因包含SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种ACTA2-MITF融合基因，其特征在于基因融合发生于ACTA2的2号外显子与MITF基因3号外显子之间；其中，ACTA2基因位于10号染色体，位置88935074-88991397，在GeneBank中的序列版本号为GRCh38.p12，共10个外显子，所述的融合基因包含SEQIDNO.3所示的核苷酸序列。2.权利要求1所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂在制备ACTA2-MITF易位性肿瘤诊断试剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述的ACTA2-MITF融合基因的检测试剂为检测ACTA2-MITF融合基因的特异性引物。4.根据权利要求3所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王小桐，饶秋，魏雪，叶胜兵，夏秋媛，李芳秋，周晓军，
申请(专利权)人：中国人民解放军南京军区南京总医院，
类型：发明
国别省市：江苏,32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。