嵌合蜘蛛丝及其用途制造技术

本申请涉及嵌合蜘蛛丝及其用途。披露了被工程化为拥有并表达嵌合蜘蛛丝蛋白基因的转基因蚕，该基因编码具有对于蜘蛛丝弹性和/或强度基序序列是特定的蜘蛛丝结构域的嵌合蜘蛛丝蛋白。还提供了具有相对于天然蚕丝纤维改进的强度(张力)和弹性特征的改进的蚕丝纤维。还提供了采用在此披露的转基因蚕制备嵌合丝纤维的改进的方法，该方法采用基于piggyBac的载体系统和辅助质粒。提供了基因表达盒，且其用于创造多种合成的蜘蛛丝编码序列(蜘蛛2、蜘蛛4、蜘蛛6、蜘蛛8)。在辅助质粒的存在下，使用piggyBac载体系统转化突变的蚕，以将嵌合蜘蛛丝基因合并入蚕中以提供稳定的转化体。因而这些转基因蚕提供了适于丝纤维的商业生产的有效的蜘蛛丝生产有机体。

Chimeric Spider Silk and Its Use

This application relates to chimeric spider silk and its use. Transgenic silkworms engineered to possess and express a chimeric spider silk protein gene encoding a chimeric spider silk protein whose elastic and/or strength motif sequence is a specific spider silk domain are disclosed. The improved silk fibers with improved strength (tension) and elasticity characteristics relative to natural silk fibers are also provided. An improved method for preparing chimeric silk fibers by using the transgenic silkworm disclosed herein is also provided. The method uses a vector system based on piggyBac and an auxiliary plasmid. Gene expression boxes are provided and used to create a variety of synthetic spider silk coding sequences (spider 2, spider 4, spider 6, spider 8). In the presence of auxiliary plasmids, the mutant silkworm was transformed by piggyBac vector system to incorporate chimeric spider silk genes into silkworm to provide stable transformants. Therefore, these transgenic silkworms provide effective spider silk production organisms suitable for commercial production of silk fibers.

【技术实现步骤摘要】
嵌合蜘蛛丝及其用途本申请是申请日为2011年9月28日，申请号为201180057127.1，专利技术名称为“嵌合蜘蛛丝及其用途”的申请的分案申请。相关申请的交叉引用本申请是在2011年9月28日提交的国际申请号PCT/US2011/053760的延续案，该申请要求对2010年9月28日提交的美国临时专利申请号61/387,332在35U.S.C.§119(e)下的优先权，其披露通过引用结合在此。关于联邦赞助的研究或发展的声明由于工作受来自国家生物医学成像和生物工程研究所，美国国立卫生研究院(DLJ)的批准号R21EB007247的支持，美国政府可以拥有对本申请中的技术的权利。共同研究协议是在圣母大学研究部(MJF)内签订，以及与KraigBioCraft实验室公司(MJF)签订了一个研究协议。序列表通过引用的结合创建于2013年3月21日、修改于2013年3月21日的、文件大小为180,265字节的、包含在文件“[127191_0011_US_ST25]”中的序列表通过引用以其全文结合在此。国际申请号PCT/US2011/053760的序列表以及美国临时专利申请号61/387,332的序列表(若有的话)也通过引用以其全文由此结合。专利
本专利技术因为提供了具有改进的强度和柔性特征的嵌合蜘蛛丝纤维，故涉及丝纤维的领域。此外，本专利技术因为提供了用于采用一种具有特定蜘蛛丝基因序列(蜘蛛丝强度和/或蜘蛛丝柔性和/或弹性基序序列)的工程化的转基因蚕来生产一种改进的丝纤维(具体而言为一种蚕/蜘蛛丝嵌合纤维)的方法，故涉及生产嵌合的丝纤维的方法的领域。由于描述了被工程化为包括一种嵌合的蚕序列的转基因蚕(该嵌合的蚕序列包括对于蜘蛛丝柔性和/或弹性基序以及蜘蛛丝强度基序的特定的蜘蛛丝基因序列)以及用于采用一种特定设计的piggyBac载体来创造这些转基因蚕的方法，故本专利技术还涉及转基因有机体。还提供了采用所述的转基因蚕针对嵌合的丝纤维的商业生产方法。专利技术背景丝纤维已经作为用于多种多样的重要外科手术的缝合线而被使用多年。需要更精细的纤维作为用于眼睛、神经、以及整容手术的缝合线。丝纤维还有作为用于以下项的材料的很大希望：人工韧带、人工腱、用于烧伤患者中皮肤移植的弹性绷带、以及可以在骨、牙周、以及结缔组织的再生期间提供支持并且在一些例子中提供临时功能的支架。由于在老龄化人口中需要外科修复的前交叉韧带(ACL)以及其他的关节损伤的发生增加，丝纤维作为用于韧带和腱的材料的发展有望变得日益重要。当前用作缝合线的小比例的纤维是从天然的蚕丝衍生，而大多数是作为合成的聚合物而被化学企业生产。此方法的主要限制是它仅能提供具有窄范围的物理特性(例如直径、强度以及弹性)的丝纤维。多种多样的的重组系统已经用于生产不同的丝蛋白质，这些重组系统包括：细菌(路易斯(Lewis)等人1996)、酵母(凡恩斯托克(Fahnestock)和别济克(Bedzyk)，1997)、杆状病毒感染的昆虫细胞(许梅里希(Huemmerich)等人2004)、哺乳动物细胞(拉扎里斯(Lazaris)等人2002)以及转基因植物(舍勒(Scheller)等人2001)。然而，所有这些系统没有被天然地设计为纺造丝(spinsilk)，并且因此还没有一种已经确实生产出有用的丝纤维。为了使丝纤维从商业角度来说被认为是有用的，该纤维必须拥有足够的张力(强度)以及柔性和/或弹性特征，并且适用于创造在所希望的商业应用中的纤维。因此，继续存在一种对于可用于此目标的系统的需要。蜘蛛丝蛋白质已经在一些异源蛋白生产系统中得以生产。在各个情况中，生产的蛋白质的量远低于实际商业水平。可以将转基因植物和动物表达系统按比例扩大，但是即使在这些系统中，重组蛋白质生产水平也会不得不被实质性地增加至呈有成效的。甚至更困难的问题是先前的生产努力已经产生了蛋白质，但不是纤维。因而，这些蛋白质必须使用一种后期生产(post-production)方法而被纺造成纤维。由于这些生产和纺造问题，依然没有能生产足够长以致具有商业利益的蜘蛛丝纤维(即“有用的”纤维)的重组蛋白质生产系统的实例。先前报道的生产纤维的尝试使用了一种哺乳动物细胞系统以表达对来自蜘蛛十字园蛛(A.diadematus)的MaSp1、MaSp2、以及相关的丝蛋白质进行编码的基因(拉扎里斯(Lazaris)等人2002)。这个工作导致60Kd蜘蛛丝蛋白质—ADF-3的生产，该ADF-3被纯化并且用于使用后期生产纺造(post-productionspinning)方法来生产纤维。然而，此系统并非一致地生产有用的纤维。此外，由于溶解这些蛋白质、开发成功的纺造条件、以及进行后期纺造牵拉以得到具有有用特性的纤维的需要，此方法是有问题的。本领域仍然缺乏用于一致地提供这样一种丝纤维产物的商业方法：该丝纤维产物具有制造用途中所需要的必要张力和柔性特征。专利技术概述本专利技术解决了本领域中描述的以上的以及其他的困难。具体而言，提供了一种可适配为商业等级的转基因蚕生产系统，由于它被天然地装备为纺造丝纤维而绕开了与蛋白质纯化、溶解、以及人工后期生长纺造相关联的问题。在广义上以及整体意义上，本专利技术提供了一种用于生产嵌合蜘蛛丝纤维的生物技术方法，该途径使用转基因蚕作为具有优越的张力和柔性特征的商业上有用的嵌合丝纤维的异源丝蛋白生产的平台。嵌合的丝纤维可以按用户需要被设计为提供具有特定范围的所希望物理特性的、或具有预定特性的纤维，被优化用于所希望的生物医药应用。蜘蛛/蚕丝蛋白质以及嵌合蜘蛛丝纤维：在一方面，本专利技术提供了一种重组嵌合蜘蛛丝/蚕丝蛋白质，该蛋白质由一种序列进行编码，该序列包括一个或多个蜘蛛丝柔性和/或弹性基序/结构域序列和/或一个或多个蜘蛛丝强度结构域序列。在一些实施例中，该嵌合的蜘蛛/蚕丝蛋白质被进一步描述为编码一种蜘蛛2、蜘蛛4、蜘蛛6或蜘蛛8嵌合的蜘蛛/蚕丝蛋白质。此外，本专利技术提供了从嵌合的蚕/蜘蛛丝蛋白质制备的嵌合蜘蛛丝纤维。在具体实施例中，嵌合蜘蛛丝纤维被描述为具有与天然蚕丝纤维相比而言较大的拉伸强度，并且在一些实施例中，具有与天然蚕纤维相比而言大于高达2倍的拉伸强度。转基因蚕：在另一方面，本专利技术提供了转基因有机体，具体地是重组的昆虫和转基因动物。在一些实施例中，该转基因有机体是一种转基因蚕，例如转基因家蚕(Bombyxmori)。在具体实施例中，有待被转化以提供转基因蚕的宿主蚕将是一种缺乏生产天然丝纤维的能力的突变的蚕。在一些实施例中，该蚕突变体是pnd-w1。在一些实施例中，突变的蚕(家蚕)将使用piggyBac系统而被转化，其中piggyBac载体是使用一种表达盒来制备，该表达盒包括在侧翼有家蚕fhc蛋白质的N-和C-末端片段的合成蜘蛛丝蛋白质序列。通常，蚕转化涉及通过显微注射蚕卵而将piggyBac载体与对piggyBac转座酶进行编码的辅助质粒的混合物引入前胚盘胚胎中。使用经校准以刺破绒毛膜的eppendorf机器针操纵器来创造微插入开口，通过该微插入开口将一个玻璃毛细管插入，通过该玻璃毛细管将DNA溶液注入蚕卵中。然后允许被注入的卵成熟，并且进展为孵化成幼虫。允许幼虫成熟为成熟的蚕，并且根据蚕的常规的生命周期吐丝成茧。这些转基因昆虫与彼此或本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种核酸，所述核酸包含：(a)5’末端piggyBac转座子的重复区；(b)包含家蚕丝心蛋白重链(fhc)‑基因的主启动子、上游增强子元件(UEE)和基础启动子的序列；(c)编码嵌合蜘蛛丝多肽的序列，其中所述嵌合蜘蛛丝多肽以从N末端到C末端的方向包含：家蚕丝心蛋白重链(fhc)丝多肽的N‑末端片段；一个或更多个选自由弹性基序序列和强度基序序列组成的组的蜘蛛丝基序序列；以及家蚕fhc丝多肽的C‑末端片段；其中所述一个或更多个蜘蛛丝基序序列包括蜘蛛丝基序序列的14至42个重复片段，每个重复片段以从N末端到C末端的方向包括8至16个拷贝的弹性基序序列(E)和一个拷贝的强度基序序列(S)；其中所述弹性基序序列包含鞭状样弹性基序序列；并且其中所述强度基序序列是牵丝强度基序序列；(d)包含家蚕丝心蛋白重链(fhc)‑基因的转录终止位点和聚腺苷酸化位点的序列；和(e)3’末端piggyBac转座子的重复区。

【技术特征摘要】
2010.09.28 US 61/387,3321.一种核酸，所述核酸包含：(a)5’末端piggyBac转座子的重复区；(b)包含家蚕丝心蛋白重链(fhc)-基因的主启动子、上游增强子元件(UEE)和基础启动子的序列；(c)编码嵌合蜘蛛丝多肽的序列，其中所述嵌合蜘蛛丝多肽以从N末端到C末端的方向包含：家蚕丝心蛋白重链(fhc)丝多肽的N-末端片段；一个或更多个选自由弹性基序序列和强度基序序列组成的组的蜘蛛丝基序序列；以及家蚕fhc丝多肽的C-末端片段；其中所述一个或更多个蜘蛛丝基序序列包括蜘蛛丝基序序列的14至42个重复片段，每个重复片段以从N末端到C末端的方向包括8至16个拷贝的弹性基序序列(E)和一个拷贝的强度基序序列(S)；其中所述弹性基序序列包含鞭状样弹性基序序列；并且其中所述强度基序序列是牵丝强度基序序列；(d)包含家蚕丝心蛋白重链(fhc)-基因的转录终止位点和聚腺苷酸化位点的序列；和(e)3’末端piggyBac转座子的重复区。2.如权利要求1所述的核酸，其中所述弹性基序是鞭状丝弹性基序GPGGA(SEQID号:2)，并且所述牵丝强度基序是牵丝强度基序GGPSGPGSAAAAAAAA(SEQID号:3)。3.如权利要求2所述的核酸，其中蜘蛛丝基序的至少一个所述重复片段选自由以下组成的组：包含一个拷贝的SEQID号:43和一个拷贝的SEQID号:3的序列；和包含一个拷贝的SEQID号:41和一个拷贝的SEQID号:3的序列。4.一种包括如权利要求1-3中任一项所述的核酸的载体。5.一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：马尔科姆·詹姆斯·弗雷泽，兰迪·刘易斯，唐·贾维斯，金佰利·汤普森，约瑟夫·赫尔，苗云根，弗洛伦斯·特磊，宋丰熙，金荣洙，
申请(专利权)人：圣母大学，
类型：发明
国别省市：美国,US