一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物技术

本发明专利技术公开一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体表达的多靶向miRNA海绵体序列以miR‑155和miR‑31成熟序列为靶标分子。本发明专利技术的质粒载体对miR‑155的抑制作用和对miR‑31的抑制作用存在协同效果；其对肿瘤细胞的抑制作用比单独靶向miR‑155或miR‑31的miRNA海绵序列质粒载体对肿瘤细胞的抑制作用都要显著提高。

A multi-targeting plasmid vector containing microRNA cavernous sequence and its construction method and primer composition

The invention discloses a multi-targeting microRNA cavernous sequence plasmid vector and a construction method thereof. The multi-targeting microRNA cavernous sequence expressed by the multi-targeting microRNA cavernous sequence plasmid vector takes the mature sequences of microRNA155 and microRNA31 as target molecules. The plasmid vector of the present invention has synergistic effect on the inhibition of microRNA 155 and microRNA 31, and its inhibition on tumor cells is significantly higher than that of microRNA sponge sequence plasmid vector targeting microRNA 155 or microRNA 31 alone.

【技术实现步骤摘要】
一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物
本专利技术属于分子生物学与生物技术医药领域，具体地，本专利技术涉及一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体及其构建方法、引物组合物。
技术介绍
癌症是细胞中的基因日积月累发生突变的结果，肿瘤细胞通常积累了多个遗传和表观遗传异常，但是研究发现多种肿瘤的生存和发展仅依赖于某个或者几个激活的致癌蛋白或信号转导通路，如果一旦这些特定的基因或者信号通路被抑制、失活或者阻断，肿瘤细胞就会出现生长和转移被抑制以及凋亡增多的现象，这就是肿瘤细胞的癌基因成瘾。而当MicroRNA(miRNA)在肿瘤发生发展中的功能被越来越多地报道，肿瘤细胞对于起癌基因作用的miRNA的成瘾(oncomiRaddiction)也被提出并直接证明，因此miRNA作为癌症治疗靶标分子的研究逐渐成为热点。miRNA是在真核生物中发现的一类在进化上高度保守具有调控功能的小非编码RNA(18-24碱基)，它们主要通过抑制mRNA翻译或促进其降解参与基因表达水平的调控。在大量生理及病理过程中miRNA都发挥着重要的作用，例如发育、分化、细胞凋亡、癌症及糖尿病等。miRNA不仅在多种肿瘤中被发现表达异常或者出现突变，而且其突变或者异位表达对肿瘤发生发展具有重要作用。在miRNA生物合成过程中任何步骤的缺陷均可能造成起抑癌作用的它的表达的下调，从而引起下游靶蛋白(癌基因)的表达上调，并最终导致细胞增殖及侵袭能力增强、凋亡减弱和血管生成增强，促进肿瘤的形成。反之起癌基因作用的miRNA(oncomiR)的过表达也是导致肿瘤发生的原因，由于oncomiR基因的扩增，持续性的启动子激活等原因引起表达增加，导致靶基因(抑癌基因)表达下降并引起肿瘤形成。FrankJ.Slacka等在小鼠体内中使用四环素诱导表达系统高表达miR-21后发现小鼠出现血液系统恶性肿瘤，而当撤回miR-21的表达时肿瘤出现消退，说明miR-21起始了小鼠体内肿瘤的形成并且对肿瘤的维持是必要的，也就是小鼠体内的肿瘤对miR-21成瘾。FrankJ.Slacka等之后在小鼠淋巴组织中高表达miR-155得到相似的结果。这有力地证明了oncomiR成瘾理论，说明虽然肿瘤细胞中具有多种多样的基因突变，但是抑制特定一个或者几个miRNA的功能就可起到抑制甚至杀伤肿瘤细胞的作用。因此，诱导特定oncomiR在肿瘤细胞中发生功能缺失从而达到抗肿瘤作用的靶向疗法也正成为一种新兴治疗策略。目前，使miRNA功能缺失的方法主要分为两大类，一是化学合成的寡核苷酸类似物类抑制剂，一是基于载体或病毒的克隆类抑制剂。化学合成的寡聚核苷酸类miRNA抑制剂包括锁核酸(Lockednucleicacid，LNA)、化学修饰的寡核苷酸(如antagomiRs)和多肽核酸(peptidenucleicacids，PNA)等，它们可通过显微注射、静脉注射的方式进入组织及细胞内，瞬时或短期在细胞或体内抑制miRNA的功能。但是，它们进入体内后对于组织没有选择性，例如JanKrützfeldt等通过尾静脉注射antagomir-16后，在心、肝、肾和骨骼肌等十几种组织器官中都检测到miR-16的沉默。于是ChristopherJ.Cheng等将靶向肿瘤酸性微环境的多肽pHLIP与miR-155抑制剂结合，使miRNA抑制剂在不引起系统毒性的基础上特异性地抑制肿瘤组织内miR-155功能并抑制肿瘤生长。基于载体或病毒的克隆类抑制剂是2007年由麻省理工大学的PhillipSharp等开发的一种长期稳定抑制miRNA的方法。其中起效果的miRNA海绵是一条人为改造的mRNA，其3’非翻译区(UTR)包含若干个在RISC切割位点有几个错配的miRNA靶位点，导致此mRNA在吸附miRNA的同时不会被降解，让miRNA远离其天然的mRNA靶点从而功能出现缺失。作为mRNA，它需由质粒(病毒)载体通过转(感)染进入细胞后介导其在细胞中的表达。相较于化学合成类抑制剂，miRNA海绵可稳定在细胞内表达发挥功能，具有作用效果更加长久的优势。这一方法现被广泛用于miRNA功能缺失转基因动物构建等基础研究领域以及肿瘤靶向治疗的探索研究。如CarlosM.Loya等将miRNA海绵序列置于果蝇UAS(upstreamactivesequence，UAS)上游激活序列下游，配合带组织特异性启动子的GAL4基因实现了miRNA在果蝇中组织特异性功能缺失，为在果蝇中研究内源miRNA的功能提供了有力工具。多个研究分别揭示靶向miR-23b、miR-21和miR-10b的海绵序列在肿瘤细胞中高表达后，均表现出高效的肿瘤抑制作用，强烈提示miRNA海绵作为抗肿瘤疗法的潜力。
技术实现思路
由于申请人多年从事肺癌相关的基础研究，因此本专利申请以肺癌中发病率最高的肺腺癌为研究模型，选取两个在包括肺癌的多种肿瘤中发挥oncomiR功能的miRNA——miR-155和miR-31为靶标分子，研究此多靶向载体系统的效果。本专利技术所要解决的技术问题是提供一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，该质粒载体能稳定表达以miR-155和miR-31为靶标分子的miRNA海绵。本专利技术的质粒载体对miR-155的抑制作用和对miR-31的抑制作用存在协同效果；其对肿瘤细胞的抑制作用比单独靶向miR-155或miR-31的miRNA海绵序列质粒载体对肿瘤细胞的抑制作用都要显著提高。本专利技术所要解决的技术问题是还提供上述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法，该构建方法制备得到的pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含8个串联重复的miR-155-sponge序列和8个串联重复的miR-31-sponge序列。本专利技术所要解决的技术问题是还提供上述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法中使用到的引物组合物。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体表达的多靶向miRNA海绵体序列以miR-155和miR-31成熟序列为靶标分子。进一步的技术方案中，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含4～8个重复miR-155-sponge序列和4～8个重复的miR-31-sponge序列；所述miR-155-sponge序列与has-miR-155互补并含若干个错配碱基；所述miR-31-sponge序列与has-miR-31互补并含若干个错配碱基。优选的，本专利技术所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含8个重复miR-155-sponge序列和8个重复的miR-31-sponge序列。进一步的技术方案中，所述多靶向miRNA海绵体序列中，所述miR-155-sponge序列与has-miR-155的第9-11碱基错配，所述miR-31-sponge序列与has-miR-31的第9-11碱基错配。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案还包括提供一种引物组合物，所述引物组合物用于退火及延伸获得多靶向miRNA海绵体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其特征在于，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体表达的多靶向miRNA海绵体序列以miR‑155和miR‑31成熟序列为靶标分子。

【技术特征摘要】
1.一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其特征在于，所述多靶向miRNA海绵体序列质粒载体表达的多靶向miRNA海绵体序列以miR-155和miR-31成熟序列为靶标分子。2.如权利要求1所述的一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体，其特征在于，其表达的多靶向miRNA海绵体序列包含4～8个重复miR-155-sponge序列和4～8个重复的miR-31-sponge序列；所述miR-155-sponge序列与has-miR-155互补并含若干个错配碱基；所述miR-31-sponge序列与has-miR-155互补并含若干个错配碱基。3.如权利要求2所述的一种多靶向miRNA海绵体序列，其特征在于，所述miR-155-sponge序列与has-miR-155的第9-11碱基错配，所述miR-31-sponge序列与has-miR-31的第9-11碱基错配。4.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物用于退火及延伸获得多靶向miRNA海绵体序列并且该多靶向miRNA海绵体序列包含4～8个重复miR-155-sponge序列和4～8个重复miR-31-sponge序列。5.如权利要求4所述一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物为2个引物对，分别为获得miR-155-sponge的正、反向引物以及为获得miR-31-sponge的正、反向引物；所述miR-155-sponge和miR-31-sponge5′端引入第一酶切位点，3′端引入第二酶切位点。6.如权利要求5所述一种引物组合物，其特征在于，所述第一酶为EcoRI，所述第二酶为BamHI。7.如权利要求6所述一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物包括以下引物对：1)序列表中的序列1和序列2组成的引物对；2)序列表中的序列3和序列4组成的引物对。8.一种多靶向miRNA海绵体序列质粒载体的构建方法，其特征在于，包括：步骤A，获得pCDH-CMV-EGFP-puro质粒，酶切及测序鉴定质粒序列准确性；步骤B，根据miRbase中miR-155和miR-31成熟序列设计4重复的海绵序列引物，构建pCDH-EGFP-4xmi155sp-puro质粒及pCDH-EGFP-4xmi31sp-puro质粒，酶切及测序鉴定质粒序列准确性；步骤C，串联4重复海绵序列，构建质粒pCDH-EGFP-8xmi155-puro质粒、pCDH-EGFP-8xmi31-puro质粒、和pCDH-EGFP-8xmi155&31sp-puro质粒，酶切鉴定准确性。9.一种多靶向m...

【专利技术属性】
技术研发人员：揭君津，方荣，刘丹妮，吴琼，王一帆，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33