新型多功能双荧光素酶报告基因质粒制造技术

本发明专利技术公开了一种新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，所述质粒包含luc萤火虫荧光素酶基因、Rluc海肾荧光素酶基因、SV40 poly(A)终止信号元件以及两种独立的多克隆位点，所述两种多克隆位点分别位于所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游和下游。本发明专利技术成功地构建了包含检测基因和内参基因的双荧光素酶报告基因质粒，利于向受试细胞转入检测基因的同时，能相应带入内参基因，极大地降低了实验操作的复杂性和实验误差，该质粒在萤火虫荧光素酶基因的两端拥有多克隆位点，位于萤火虫荧光素酶上游的多克隆位点能引入启动子序列，可用于基因转录调控检测，位于萤火虫荧光素酶下游的多克隆位点能引入3’UTR序列，可用于miRNA靶标鉴定，实现同种质粒不同用途之间的转换。

【技术实现步骤摘要】
新型多功能双荧光素酶报告基因质粒
本专利技术涉及分子生物学和基因工程领域，尤其涉及一种新型多功能双荧光素酶报告基因质粒。
技术介绍
荧光素酶是生物体内催化荧光素或脂肪酫氧化发光的一类酶的总称。荧光素酶可以催化荧光素形成氧化荧光素，在荧光素氧化过程中，发出生物荧光，生物荧光的强弱可被化学发光仪检测并记录。荧光素酶报告基因系统是以荧光素为底物来检测荧光素酶活性的一种报告系统，可极其灵敏、高效地检测基因的表达，是检测基因转录或翻译调控的重要检测方法。在用荧光素酶定量检测基因表达时，通常使用第二个报告基因作为内参基因，配合检测基因，以减少实验误差。目前，市场上绝大多数双荧光素酶报告基因系统将检测基因和内参基因分别置于两个独立的质粒上，如普洛麦格公司的pGL4荧光虫荧光素酶报告基因质粒和pRL-TK海肾荧光素酶报告基因质粒。在实际操作过程中，向供试细胞同时转染检测基因和内参基因两种质粒，可能增大实验的操作误差。为了克服分别转染检测基因和内参基因所带来的弊端，普洛麦格公司还推出一种双荧光素酶报告基因质粒pmirGLO，该质粒同时包含了检测基因luc萤火虫荧光素酶和内参基因Rluc海肾荧光素酶，该质粒的使用极大的方便了双荧光素酶报告基因检测系统的操作过程，降低了实验操作误差。然而，pmirGLO中固定的启动子只能在大多数哺乳动物细胞中启动子基因表达，极大的限制了该miRNA靶标鉴定质粒的运用范围，并且pmirGLO只在萤火虫荧光素酶的下游引入了多克隆位点，该质粒只能运用于miRNA靶标鉴定，而无法运用于启动子活性调控鉴定等其它双荧光素酶报告基因检测研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种同时包含检测基因和内参基因的双荧光素酶报告基因质粒，并在制备的质粒中引入用于插入外源基因片段的多克隆位点，可用于基因转录调控研究或miRNA靶标鉴定研究，方便报告基因质粒在不同实验目的和不同细胞系之间灵活应用。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用以下技术方案：所述质粒包含luc萤火虫荧光素酶基因、Rluc海肾荧光素酶基因、SV40poly(A)终止信号元件以及两种独立的多克隆位点，所述两种多克隆位点分别位于所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游和下游。优选地，所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框上游和下游各引入一个独立的所述多克隆位点。优选地，所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框上游引入的所述多克隆位点引入启动子序列后，能用于基因转录调控检测。优选地，所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框下游引入的多克隆位点引入3’UTR序列后，能用于miRNA靶标鉴定。本专利技术的双荧光素酶报告基因质粒的构建方法如下：(1)缺失突变pmirGLO双荧光素报告基因质粒载体中的PGK启动子，经测序后转化到大肠杆菌中扩大培养，并提取PGK启动子缺失突变后的pmirGLO质粒；(2)从PGK启动子缺失突变的pmirGLO质粒中克隆Amp抗性基因序列、ori载体复制起始序列、MCS启动子多克隆位点、luc萤火虫荧光素酶基因，3’UTR多克隆位点和SV40Poly(A)终止信号元件序列；(3)从pRL-TK海肾荧光素酶报告基因质粒中克隆得到HSV-TK单纯性疱疹病毒脑腺激酶基因启动子序、Rluc海肾荧光素酶序列和SV40Poly(A)终止信号元件序列；(4)最后通过酶切连接，将步骤2和3中获得的DNA片段重组成完整的质粒，转化至DH5α大肠杆菌克隆，经测序鉴定后获得目标质粒pGLDr-Basic。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术在同一质粒中引入两种荧光蛋白，在双荧光素酶报告基因检测过程中，向细胞转染本质粒，即可将靶标荧光素酶表达基因体和内参荧光素酶表达基因同时导入细胞中，减少转染质粒的种类，降低实验误差，提高实验效率。(2)本专利技术分别在luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游和下游各引入一个独立的多克隆位点，研究人员可在萤火虫荧光素酶基因的上游引入启动子序列后，用于基因转录调控研究，或在luc萤火虫荧光素酶基因的下游引入3’UTR序列后，用于miRNA靶标鉴定研究，实现同种质粒不同用途之间的转换。(3)本专利技术pGLDr-Basic质粒使用萤火虫荧光素酶作为靶标基因，使用海肾荧光素酶作为内参基因，两种荧光素酶表达基因具有独立的启动子、编码框和Ploy(A)尾，两者在同一质粒上表达时互不干扰。(4)本专利技术pGLDr-Basic质粒在大肠杆菌中拷贝量高，有利于质粒的提取。(5)本专利技术pGLDr-Basic质粒中的Rluc内参基因在S2细胞中能够稳定表达，其表与达量随质粒转染量的增加而升高，且呈线性相关，能够满足双荧光素酶报告基因的实验要求。(6)在本专利技术pGLDr-Basic质粒中的luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游引入启动子Pro后构建成pGLDr-pro，转染细胞后luc检测基因和Rluc内参基因均能稳定表达，且两种荧光素酶荧光比值稳定，可以满足双荧光素酶报告基因检测实验要求，证明pGLDr-Basic质粒可运用于基因启动子活性检测相关实验，并且本专利技术的pGDr-Basic质粒可引入特定基因的启动子，用于启动子的转录调控研究。(7)在本专利技术pGLDr-Basic质粒的基础上构建pGLDr-Pro，再引入3’UTR，luc基因和Rluc内参基因均能稳定表达，luc检测基因与Rluc内参基因的荧光值比值稳定，能够满足双荧光素酶报告基因检测要求，并且本专利技术的pGLDr-Basic质粒能通过引入特定基因的启动子和3’UTR序列后，用于基于双荧光素酶报告基因系统的miRNA的靶标鉴定研究。附图说明图1为pGLDr-Basic质粒图谱；图2为pGLDr-Basic质粒转染细胞后，Rluc的表达结果；图3为在pGLDr-Basic质粒的luc编码框上游引入启动子Pro后，转染细胞的表达结果：A、pGLDr-Proluc的表达结果，B、pGLDr-ProRluc的表达结果；图4为在pGLDr-Pro质粒的luc编码框下游引入3’UTR序列后，转染细胞的的表达结果：A、pGLDr-Pro-3’UTRluc的表达结果，B、pGLDr-Pro-3’UTRRluc的表达结果。具体实施方式以下结合附图和具体实施例，对本专利技术的具体实施方式和技术方案作进一步的详述，应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1.质粒的构建材料：高保真酶HS(Premix)(Takara，日本)，DNALadder(东盛，中国)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Magen，中国)，限制性内切酶EcoRI(NEB，英国)，PlasmidMiniKitI(OMEGA，P/N：D6942-01)所设计的引物具体序列如表1所示表1.引物序列1.1缺失突变pmirGLO中的PGK启动子步骤：①根据pmirGLO载体序列设计并合成引物pmiRGLO-EcoRI-FseIF和pmiRGLO-EcoRI-AscIR：使用高保真酶Premix，从pmirGLO载体中克隆得到人磷酸甘油酸激酶PGK启动子序列的pmirGLO载体DNA；②PCR反应结束后用，产物经1％琼脂糖本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于，所述质粒包含luc萤火虫荧光素酶基因、Rluc海肾荧光素酶基因、SV40 poly(A)终止信号元件以及两种独立的多克隆位点，所述两种多克隆位点分别位于所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游和下游。

【技术特征摘要】
1.一种新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于，所述质粒包含luc萤火虫荧光素酶基因、Rluc海肾荧光素酶基因、SV40poly(A)终止信号元件以及两种独立的多克隆位点，所述两种多克隆位点分别位于所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框的上游和下游。2.根据权利要求1所述的新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于，所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框上游和下游各引入一个独立的所述多克隆位点。3.根据权利要求2所述的新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于，所述质粒的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示。4.根据权利要求2所述的新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于：所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框上游引入的所述多克隆位点引入启动子序列后，能用于基因转录调控检测。5.根据权利要求2所述的新型多功能双荧光素酶报告基因质粒，其特征在于：所述luc萤火虫荧光素酶基因编码框下游引...

【专利技术属性】
技术研发人员：左洪亮，徐晓鹏，李朝政，翁少萍，何建国，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东,44