一种检测常见益生菌丰度的试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测常见益生菌丰度的试剂盒，本发明专利技术人通过自有技术，从大量的数据中分析并设计、筛选出特异性最好及扩增效率最高的引物，包括Faecalibacterium、lactobacillus、Bifidobacterium、Akkermansia muciniphil和总菌引物本发明专利技术的引物，扩增特异性好，扩增效率高，可以从复杂的肠道微生物菌群总DNA中特异性扩增出相应的益生菌，其结果与成熟的方法相同。本发明专利技术的试剂盒，可以实现对常见益生菌的快速、直观的检测，缩短了检测周期，降低了检测成本。

【技术实现步骤摘要】
一种检测常见益生菌丰度的试剂盒
本专利技术涉及一种检测常见益生菌丰度的试剂盒。
技术介绍
肠道菌群大约包括两千多种菌。肠道菌群构成与生活习惯，饮食和宿主的基因密切相关，个体间存在着较大的差异。厚壁菌门，拟杆菌门，放线菌门，这三个门在人体肠道菌群中占支配地位，厌氧菌如拟杆菌属、真杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属、消化链球菌属等占了肠道菌群的主要部分，而兼性厌氧菌如乳酸杆菌属、肠球菌属、链球菌属、肠杆菌属等只占了很小的一部分。肠道菌群与宿主构成动态平衡的微生态系统，参与多种生理活动：参与营养物质消化吸收，酵解纤维素、低聚糖等产生可吸收的短链脂肪酸等；参与营养物质合成，合成维生素B族，维生素K、叶酸等；参与免疫调节，肠道菌群在机体免疫发育过程中发挥着重要作用，保持机体免疫功能处于一个适度的活跃状态；参与神经调控，肠道菌群代谢产物中含有γ氨基丁酸与五羟色胺等神经递质，通过肠脑轴调控神经系统功能；参与生长发育与衰老，肠道菌群随着年龄的增长而发生着动态变化；构成肠道黏膜的保护屏障，肠道菌群维持肠道微生态平衡，形成生物屏障，抵御致病菌的侵袭。通过检测肠道菌群的组成情况，可以对个体肠道菌群的评估、干预提供可靠的判断依据。目前检测肠道菌群方法主要包括16SrRNA测序及荧光定量PCR鉴定。16S测序通过16S通用引物扩增后通过二代测序方法鉴定肠道菌群的丰度，优点是通量较大，准确性高，缺点是操作时间长、建库流程复杂、周期较长、成本较高。荧光定量PCR肠道菌群丰度，通过设计特异性的引物对特定的DNA序列进行扩增，灵敏度、特异性高，缺点是通量较小，且引物特异性需要得到保障，优点是成本较低，实验周期较短、且成本较低。肠道菌群组成复杂，且很多菌株极其接近，直接使用荧光PCR对肠道菌群进行扩增，往往存在特异性差，扩增效率低下，现有技术中缺乏可以应对这种复杂样本的引物。如何高通量低成本地检测常见肠道菌群丰度，是一项具有挑战性的工作。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高通量、低成本的常见肠道菌群丰度检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：一种检测肠道常见益生菌丰度的引物组，包括如下序列：Faecalibacterium:上游序列：GGTCTTCGGATTGTAAACTCCTG(SEQIDNO：1)下游序列：GTAATTCCGGACAACGCTTGTG(SEQIDNO：2)lactobacillus:上游序列：GTGGAACTCCATGTGTAGCGG(SEQIDNO：3)下游序列：GGCGGAAACCCTCCAACAC(SEQIDNO：4)Bifidobacterium:上游序列：CGGGTGAGTAATGCGTGACC(SEQIDNO：5)下游序列：TGATAGGACGCGACCCCA(SEQIDNO：6)Akkermansiamuciniphila:上游序列：CGGCACATGATACTGCGAGAC(SEQIDNO：7)下游序列：TCAGTTAATGTCCAGGAACCCG(SEQIDNO：8)总菌:上游序列：CCTACGGGAGGCAGCAG(SEQIDNO：9)下游序列：ATTACCGCGGCTGCTGG。(SEQIDNO：10)一种检测肠道常见益生菌丰度的试剂盒，包括PCR反应体系，其引物组如上所示。作为上述试剂盒的进一步改进，PCR反应体系为qPCR反应体系。作为上述试剂盒的进一步改进，qPCR反应体系的组成为：成分体积(μL)荧光染料5正向引物(2.5μM)0.5反向引物(2.5μM)0.5模板DNA(2ng/μL)1UDG酶0.01水补足至10μL。作为上述试剂盒的进一步改进，荧光染料为LightCycler480SYBRGreenIMaster。作为上述试剂盒的进一步改进，PCR的程序包括：作为上述试剂盒的进一步改进，72℃时收集荧光。一种测定肠道常见益生菌丰度的方法，包括：1)提取粪便微生物基因组DNA作为模板DNA；2)使用权利要求1所述的引物组对模板DNA进行扩增；3)根据扩增结果确定肠道常见益生菌丰度。作为上述方法的进一步改进，qPCR反应体系的组成为：成分体积(μL)荧光染料5正向引物(2.5μM)0.5反向引物(2.5μM)0.5模板DNA(2ng/μL)1UDG酶0.01水补足至10μL。作为上述方法的进一步改进，荧光染料为LightCycler480SYBRGreenIMaster。作为上述方法的进一步改进，PCR的程序包括：本专利技术的有益效果是：本专利技术的引物，扩增特异性好，扩增效率高，可以从复杂的肠道微生物菌群总DNA中特异性扩增出相应的益生菌，其结果与成熟的方法相同。本专利技术的试剂盒，可以实现对常见益生菌的快速、直观的检测，缩短了检测周期，降低了检测成本。附图说明图1是Faecalibacterium及其阴性对照的qPCR曲线；图2是Lactobacillus及其阴性对照的qPCR曲线；图3是Akkermansiamuciniphila及其阴性对照的qPCR曲线；图4是Bifidobacterium及其阴性对照的qPCR曲线；图5是总菌及其阴性对照的qPCR曲线；图6是不同扩增产物的凝胶电泳结果；图7分别是Faecalibacterium和Lactobacillus扩增产物的熔解曲线；图8分别是Akkermansiamuciniphila、Bifidobacterium和总菌扩增产物的熔解曲线；图9是对照组扩增产物的凝胶电泳结果。具体实施方式专利技术人通过一系列研究，创造性针对常见肠道菌群16S或其它特异基因设计了一系列引物，并改进实验条件，对PCR扩增步骤进行分步优化，实现对常见肠道菌群的准确检测，检测结果快速、直观、方便进对个体肠道菌群的评估。下面结合实施例，对本专利技术的技术进行进一步的说明。引物设计难点在于找到细菌基因中具有特异性的序列，细菌的种属复杂，各个种属之间存在着或远或近的亲缘关系，譬如同一个科或属的细菌序列存在着极大的同源性，因此设计的引物往往存在着非特异性的扩增，不能达到特异扩增目标产物的效果。本专利技术人通过自有技术，从大量的数据中分析并设计、筛选出特异性最好及扩增效率最高的引物，这些引物具有特异性高，没有非特异性扩增的特点，PCR操作本身是较为成熟的，条件根据引物本身的条件而变化。下面结合实施例，进一步说明本专利技术的技术方案。实施例1：引物序列：Faecalibacterium:上游序列：GGTCTTCGGATTGTAAACTCCTG下游序列：GTAATTCCGGACAACGCTTGTGlactobacillus:上游序列：GTGGAACTCCATGTGTAGCGG下游序列：GGCGGAAACCCTCCAACACBifidobacterium:上游序列：CGGGTGAGTAATGCGTGACC下游序列：TGATAGGACGCGACCCCAAkkermansiamuciniphila:上游序列：CGGCACATGATACTGCGAGAC下游序列：TCAGTTAATGTCCAGGAACCCG总菌:上游序列：CCTACGGGAGGCAGCAG下游序列：ATTACCGCGGCTGCTGG。qPCR反应体系的组成为：成分体积(μL)荧光染料5正向引物(2.5μM)0.5反向引本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测肠道常见益生菌丰度的引物组，包括如下序列：Faecalibacterium:上游序列：GGTCTTCGGATTGTAAACTCCTG下游序列：GTAATTCCGGACAACGCTTGTGlactobacillus:上游序列：GTGGAACTCCATGTGTAGCGG下游序列：GGCGGAAACCCTCCAACACBifidobacterium:上游序列：CGGGTGAGTAATGCGTGACC下游序列：TGATAGGACGCGACCCCAAkkermansia muciniphila:上游序列：CGGCACATGATACTGCGAGAC下游序列：TCAGTTAATGTCCAGGAACCCG总菌:上游序列：CCTACGGGAGGCAGCAG下游序列：ATTACCGCGGCTGCTGG。

【技术特征摘要】
1.一种检测肠道常见益生菌丰度的引物组，包括如下序列：Faecalibacterium:上游序列：GGTCTTCGGATTGTAAACTCCTG下游序列：GTAATTCCGGACAACGCTTGTGlactobacillus:上游序列：GTGGAACTCCATGTGTAGCGG下游序列：GGCGGAAACCCTCCAACACBifidobacterium:上游序列：CGGGTGAGTAATGCGTGACC下游序列：TGATAGGACGCGACCCCAAkkermansiamuciniphila:上游序列：CGGCACATGATACTGCGAGAC下游序列：TCAGTTAATGTCCAGGAACCCG总菌:上游序列：CCTACGGGAGGCAGCAG下游序列：ATTACCGCGGCTGCTGG。2.一种检测肠道常见益生菌丰度的试剂盒，包括PCR反应体系，其特征在于：其引物组如权利要求1所示。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：PCR反应体系为qPCR反应体系。4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋卓，王永利，卢秦，
申请(专利权)人：人和未来生物科技长沙有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43