一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针、试剂以及试剂盒与方法技术

本发明专利技术公开了一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针、试剂以及试剂盒与方法，其中，提供的引物和探针，具有良好的灵敏性和特异性，通过实时荧光PCR方法可以定性分析环境污染降解菌剂中是否含有红串红球菌，发挥了实时荧光PCR检测技术中结果的可靠性高、灵敏度好、特异性强、操作简单快捷等优点，进一步完善了环境污染降解菌剂检测体系，加大对国际技术贸易壁垒的保护力度。

【技术实现步骤摘要】
一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针、试剂以及试剂盒与方法
本专利技术公开涉及实时荧光PCR检测的
，尤其涉及一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针、试剂以及试剂盒与方法。
技术介绍
随着人类对环境生态的保护意识日益提高，环境污染降解菌剂在环境保护、污水净化等方面的应用越来越广。目前，国内外应用于检测环境污染降解菌剂菌种技术主要有三种：形态学生理生化方法、PCR特异性扩增法、基因序列测定比对法，在实际检测中应用最多的是形态学生理生化方法和PCR特异性扩增法，PCR特异扩增法又有普通定性PCR、实时荧光PCR、巢式PCR等。近年来，我国每年从美国、日本等地进口环保微生物菌剂达二十万余吨，用于生物防控，随着我国环保意识的增强，进口量将逐年增多，需求量将越来越大，为了增加进口环保微生物菌剂的质量安全，保护我国自然环境不受外来菌种的破坏，需要尽快建立环境污染降解菌剂中红串红球菌的检验方法。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术公开提供了一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针、试剂以及试剂盒与方法，以弥补我国在环境污染降解菌剂中红串红球菌的检测空白。本专利技术一方面提供了一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针，所述引物包括上游引物P1以及下游引物P2；所述上游引物P1具有SEQNo.1序列；所述下游引物P2具有SEQNo.2序列；所述探针具有SEQNo.3序列。优选，所述探针的5'端用报告荧光染料FAM标记，所述探针的3'端用淬灭荧光染料TAMRA标记。本专利技术还提供了一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的试剂，所述试剂中含有上述的引物和探针。本专利技术同时还提供了一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的试剂盒，所述试剂盒中含有上述的引物和探针或含有上述的试剂。优选，所述试剂盒还含有DNA聚合酶反应液、空白对照品、阳性对照品以及阴性对照品。本专利技术另一方面还提供了一种检测红串红球菌的实时荧光PCR方法，所述方法采用上述引物和探针或上述试剂或上述试剂盒，具体步骤如下：——提取待测样品基因组DNA；——以所提取的DNA为模板，加入引物、探针以及DNA聚合酶反应液进行实时荧光PCR反应，其中，反应条件为：50℃10min，95℃15min，循环1次；95℃15s，57℃30s，循环40次，记录样品反应Ct值；——在样品检测的同时，设置空白对照、阴性对照以及阳性对照，其中，空白对照以ddH2O为模板，按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阴性对照以非红串红球菌基因组DNA为模板，按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阳性对照以红串红球菌基因组DNA或目的基因质粒片段为模板，按照上述条件进行实时荧光PCR反应，检测Ct值小于或等于35；——若待测样品红串红球菌基因检测Ct值大于或等于40，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品未检出红串红球菌基因；若待测样品红串红球菌基因检测Ct值小于或等于35，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品检出红串红球菌基因；若待测样品红串红球菌基因检测Ct值在35～40之间，重做实时荧光PCR扩增，再次扩增后结果Ct值大于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该待测样品未检出红串红球菌基因，再次扩增后结果Ct值仍小于40且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，判定该检测样品检出红串红球菌基因本专利技术提供的基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针，具有良好的灵敏性和特异性，通过实时荧光PCR方法可以定性分析环境污染降解菌剂中是否含有红串红球菌，发挥了实时荧光PCR检测技术中结果的可靠性高、灵敏度好、特异性强、操作简单快捷等优点，进一步完善了环境污染降解菌剂检测体系，加大对国际技术贸易壁垒的保护力度。附图说明此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本专利技术的实施例，并与说明书一起用于解释本专利技术的原理。为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术实施方案中检测红串红球菌阳性样品的荧光PCR扩增图；图2为本专利技术实施方案中样品检测的荧光PCR扩增图；图3、图4为本专利技术实施方案中关于灵敏性和重复性的荧光PCR扩增图；图5为本专利技术实施方案中关于特异性的荧光PCR扩增图。具体实施方式下面以具体的案例对本专利技术进行进一步解释，但并不用于限制本专利技术的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用产品均为市购。下面结合具体的实施例对本专利技术的检测过程进行进一步的详细说明，具体如下：1、引物以及探针设计选择红串红球菌DNA(GenBankNR_076267.1)作为靶序列，通过PrimerExploreV4在线设计软件分别设计并合成实时荧光PCR特异性扩增引物和探针，具体如下：实时荧光PCR引物包括上游引物P1和下游引物P2以及探针，其中，上游引物P1：ACCGAAGCTGCGGCATT(SEQNo.1)；下游引物P2：GCCAGAAAATCCTTGGATCAAC(SEQNo.2)；探针：ACGCAATAGCCCCC(SEQNo.3)，且该探针的5'端用报告荧光染料FAM标记，3'端用淬灭荧光染料TAMRA标记。2、样品DNA的提取与纯化将红串红球菌增菌的营养肉汤2mL加到2mL无菌离心管中，10000r/min离心2min，弃上清，尽量弃净上清，沉淀加入TE缓冲液570μL重悬，然后加入10mg/mL溶菌酶100μL，37℃温育30min，再加入10％SDS30μL，65℃温育10min，加入等体积的酚混匀，12000r/min离心10min，取上清移入一新离心管中，重复一次，两次酚抽提后取上清加等体积的酚/氯仿(1：1体积比)混匀，12000r/min离心10min，取上清再移入一新离心管中，加等体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L乙酸钠，轻缓颠倒混匀，12000r/min离心10min，弃上清，沉淀用500μL75％乙醇洗两次，离心管开盖室温放置数分钟使乙醇浑发，加入100μL无菌水(预先加热至65℃有利于DNA溶解)，-20℃保存以待检测。也可使用等效的商业化的DNA提取试剂盒并按其说明提取制备模板DNA。3、建立实时荧光PCR扩增反应体系2×RealMasterMix12.5μL、正向引物(10pmol/μL)1μL、反向引物(10pmol/μL)1μL、探针(5pmol/μL)1μL、DNA模板20ng、ddH2O补充至25μL。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。4、实时荧光PCR扩增反应按照仪器操作要求选择相应的荧光通道，设置扩增反应条件50℃10min，95℃15min，循环1次；95℃15s，57℃30s，循环40次，记录样品反应Ct值；5、确定质量控制指标空白对照以ddH2O为模板，按照3和4所述条件，进行实时荧光PCR反应，检测Ct值大于或等于40；阴性对照以非红串红球菌基因组DNA为模板，按照3和4所述条件，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物P1以及下游引物P2；所述上游引物P1具有SEQ No.1序列；所述下游引物P2具有SEQ No.2序列；所述探针具有SEQ No.3序列。

【技术特征摘要】
1.一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针，其特征在于，所述引物包括上游引物P1以及下游引物P2；所述上游引物P1具有SEQNo.1序列；所述下游引物P2具有SEQNo.2序列；所述探针具有SEQNo.3序列。2.根据权利要求1所述基于实时荧光PCR检测红串红球菌的引物和探针，其特征在于，所述探针的5'端用报告荧光染料FAM标记，所述探针的3'端用淬灭荧光染料TAMRA标记。3.一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述的引物和探针。4.一种基于实时荧光PCR检测红串红球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的引物和探针或含有权利要求3所述的试剂。5.根据权利要求4所述基于实时荧光PCR检测红串红球菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还含有DNA聚合酶反应液、空白对照品、阳性对照品以及阴性对照品。6.一种检测红串红球菌的实时荧光PCR方法，所述方法采用权利要求1所述引物和探针或权利要求3所述试剂或权利要求4、5所述试剂盒，其特征在于，具体步骤如下：——提取待测样品基因组DNA；——以所提取的DNA为模板，加入引物、探针以及DNA聚合酶反应液进行实时荧光PCR反...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金玲，陈文锐，张莹，凌莉，韩宏乾，
申请(专利权)人：沈阳出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：辽宁,21