高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供一种高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒。其中，特别针对幽门螺杆菌CagA基因的核酸序列，设计5条LAMP检测引物，包括外引物F3、B3；内引物FIP、BIP，环引物LB，保证了LAMP扩增的高度特异性。该技术对高毒力株幽门螺杆菌的检测特异性强，具有快速、高效、仪器要求简易、操作简便，成本低，易于在基层推广使用的特点。同时，本发明专利技术首次设计、筛选到高毒力株幽门螺杆菌LAMP检测引物，并建立了高毒力株幽门螺杆菌LAMP检测方法，填补了国内外在此检测领域的空白。

【技术实现步骤摘要】
高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒
本专利技术属于医学分子生物学诊断
，具体涉及一种高毒力株幽门螺杆菌的环介导等温扩增检测方法和试剂盒。
技术介绍
该部分内容仅提供与本专利技术有关的背景信息，并不必然构成现有技术。幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，HP)是一种微需氧，显微镜下呈螺旋形的革兰氏阴性杆菌。是目前所知能够在人体胃液中生存的唯一微生物种类。流行病学调查显示，世界范围内HP在普通人群的感染率高达50％以上，发展中国家甚至达到70％～90％。感染的分布也存在差异，经济越落后、文化水平越低感染率越高。幽门螺旋杆菌感染可表现为胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等。HP胃部感染的不良预后是胃癌，早在1994年国际癌症研究中心就将其列为I类致癌物。长期以来HP感染及机制一直是世界关注及研究的热点之一。但是，流行病学调查显示，并非所有感染HP者均导致胃部疾病，感染者只有10％发展为有明显症状的消化性溃疡或者胃炎，最终发展成胃癌的仅占1％左右。究竟是什么关键因素最终导致HP感染后的不同结局呢？研究表明，人体感染HP除了遗传易感性及环境易感性之外，还与其具有独特的毒力因子有关，例如尿素酶、鞭毛蛋白、粘附因子、细胞毒素相关蛋白(CagA)和空泡细胞毒素(VacA)等。已经公认，由CagA基因编码的CagA蛋白是最重要的毒力因子之一，CagA蛋白可以通过诱导更多的酪氨酸磷酸化和白介素-8的分泌，也可以通过调节一些信号通道系统，刺激肿瘤细胞增殖和提高肿瘤细胞侵袭作用而促进胃癌的发生。HP菌株可以根据有无CagA基因将其分为两种类型，一种是高毒力HP株，有CagA基因，表达CagA蛋白，具有毒素活性，可导致胃部炎症或者胃癌；另一种为低毒力HP株，无CagA基因，不表达CagA蛋白，不具备毒素活性，不会引起胃炎等疾病的发生。因此，CagA基因被认为高毒力HP菌株最重要的标志物，如果能够通过某种方法，只检测CagA基因，从而把携带有CagA蛋白的高毒力HP株的人群筛选出来，利用三联或者四联药物加以根治，就可以大大减少由HP感染造成的胃癌的发病率。临床上检测HP的方法有许多种，例如血清学实验、呼气实验、分离培养法、尿素酶法、分子生物学(如PCR)法等。各有利弊，如血清法检测抗体，不适合现症感染；呼气试验容易受抗生素、铋制剂等敏感药物干扰导致假阳性，而且放射性元素会对人体有一定危害，尤其不适用于孕妇和小儿；分离培养法是目前公认的诊断Hp感染的“金标准”，但培养条件要求苛刻，敏感性低且耗时费力；胃幽门螺旋杆菌快速尿素酶法属于侵入性有创检查，患者痛苦较大，且适用于用药前的首次胃镜检查，不适合复检。以上几种方法均侧重于HP的普查，并不能区分高毒力菌株和低毒力菌株，有文献报道可以通过PCR检测毒力基因CagA或者尿素基因(UreA)来诊断高毒力HP感染，PCR方法灵敏高效，但费用高昂，不适合在基层医院推广普及。环介导基因恒温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplificationofnucleicacid,LAMP)是一种新型恒温基因扩增技术，其通常是针对靶基因的六个独立区域设计两对特殊内、外引物，同时利用Bst脱氧核苷酸聚合酶启动循环链置换反应，完成核酸扩增。该技术具有快速、简便、敏感性和特异性高、检测范围广等优点。近年来，该技术已逐步应用于病原微生物的检测，但目前尚未见该方法应用于高毒力幽门螺旋杆菌的检测，更无合适高效的引物用于该领域的LAMP检测。
技术实现思路
针对上述现有技术的不足，本专利技术基于CagA基因在幽门螺杆菌菌株中稳定性与独特性，提供了一种速度快、灵敏度高、特异性检测高毒力株幽门螺杆菌的LAMP检测用引物组及检测方法以及试剂盒。本专利技术的目的之一在于提供一种检测高毒力株幽门螺杆菌的LAMP检测用引物，所述LAMP检测引物包括：F3:5'-GGGAGAAAAATGTTACTCTTCA-3'(SEQIDNO.1)；B3:5'-CGAAACTAGTGATAGCGAGAT-3'(SEQIDNO.2)；FIP:5'-GAGGCGTTGGTGTATTTGAA-CCTAAAACATGATGGCGTG-3'(SEQIDNO.3)；BIP:5'-GAATCCCAATAAGGGTGTAGGCG-GCAAATTAAAGATAGCTACCTTGT-3'(SEQIDNO.4)；LB:5'-GGCGTTTCCCATTTAGAAGTAGG-3'(SEQIDNO.5)。本专利技术的目的之二在于提供上述引物组在基于环介导等温扩增法检测高毒力株幽门螺杆菌中的应用。本专利技术的目的之三在于提供一种检测高毒力株幽门螺杆菌的LAMP检测方法，所述方法包括使用上述LAMP检测用引物进行LAMP扩增。具体的，所述检测方法包括：S1.配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增；S2.通过肉眼观察反应管颜色变化判断检测样品中是否含有高毒力株幽门螺杆菌。其中，所述步骤S1中，LAMP反应体系为：5pM的外引物F3和B3各1μl；40pM的内引物FIP和BIP各1μl；20pM环引物LB1μl；2×反应缓冲液12.5μl；1μl的BstDNA聚合酶；荧光染料1μl；2μl的待测DNA样品，加去离子水至25μl体系。其中，所述DNA模板包括但不限于从纯培养菌落、胃粘膜组织、胃液、肠液、唾液、牙斑、粪便中获得的DNA样品；由于本专利技术检测方法的高灵敏度和高特异性，本专利技术中DNA样品通过沸水浴法获得DNA粗提物即可正常使用，无需昂贵的提取试剂和繁杂的提取步骤。LAMP反应条件为：63℃恒温60min。所述步骤S2中，如肉眼观察反应产物为绿色浑浊液体，则确认含有高毒力株幽门螺杆菌；如反应产物为橙色透明液体，则表明不含有高毒力株幽门螺杆菌。本专利技术的目的之四在于提供一种高毒力株幽门螺杆菌的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括前述引物组、反应缓冲液、BstDNA聚合酶。其中，所述反应缓冲液组分如下：Tris-HCl0.8μmol；KCl0.4μmol；MgSO40.32μmol；(HN4)2SO40.4μmol；Tween200.04μl；甜菜碱32μmol；4×dNTPs0.056μmol；所述试剂盒还包括荧光染料。本专利技术的目的之五在于提供上述试剂盒在基于环介导等温扩增法检测高毒力株幽门螺杆菌中的应用。本专利技术的有益技术效果：1.直接检测高毒力基因CagA，只筛选CagA阳性的患者进行药物治疗，阴性者不予处理，避免“滥杀无辜”。2.从分子水平检测基因，敏感性高于血清法、呼气法、培养法、尿素酶法等传统方法，当细菌感染数量很低时，仍能获得理想的试验结果。3.应用5条引物识别CagA基因的7个片段进行扩增，特异性高于PCR方法，提取DNA无需专门的试剂盒，只需要沸水浴10min，12000rpm×4min离心粗提DNA即可，避免了引入化学试剂对后续核酸扩增的影响。4.可预先将每个反应所需试剂、引物及染料混合并分装于各反应管中，检测时只需要在反应管中加入样本DNA，盖好管盖，放入水浴锅，从反应开始至结果判读均不需要打开反应管，避免因多次加样带来的污染及随机误差。5.反应速度快，产量大，可在30-60min内完成并肉眼可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测高毒力株幽门螺杆菌的LAMP检测用引物，其特征在于，所述LAMP检测引物包括：F3:5'‑GGGAGAAAAATGTTACTCTTCA‑3'；B3:5'‑CGAAACTAGTGATAGCGAGAT‑3'；FIP:5'‑GAGGCGTTGGTGTATTTGAA‑CCTAAAACATGATGGCGTG‑3'；BIP:5'‑GAATCCCAATAAGGGTGTAGGCG‑GCAAATTAAAGATAGCTACCTTGT‑3'；LB:5'‑GGCGTTTCCCATTTAGAAGTAGG‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种检测高毒力株幽门螺杆菌的LAMP检测用引物，其特征在于，所述LAMP检测引物包括：F3:5'-GGGAGAAAAATGTTACTCTTCA-3'；B3:5'-CGAAACTAGTGATAGCGAGAT-3'；FIP:5'-GAGGCGTTGGTGTATTTGAA-CCTAAAACATGATGGCGTG-3'；BIP:5'-GAATCCCAATAAGGGTGTAGGCG-GCAAATTAAAGATAGCTACCTTGT-3'；LB:5'-GGCGTTTCCCATTTAGAAGTAGG-3'。2.权利要求1所述引物组在基于环介导等温扩增法检测高毒力株幽门螺杆菌中的应用。3.一种检测高毒力株幽门螺杆菌的LAMP检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1所述LAMP检测用引物进行LAMP扩增。4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：S1.配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增；S2.通过肉眼观察反应管颜色变化判断检测样品中是否含有高毒力株幽门螺杆菌。5.如权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中，LAMP反应体系为：5pM的外引物F3和B3各1μl；40pM的内引物FIP和BIP各1μl；20pM环引物LB1μl；2×反...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪运山，曹翠明，杨炜华，裴凤艳，
申请(专利权)人：济南市中心医院，
类型：发明
国别省市：山东,37