本发明专利技术提供一种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法，是利用基因工程技术将重组质粒pUC-ureB及pUC-cagA构建重组质粒pIRES-ureB-cagA，转化，筛选，扩增及鉴定后，化学转化活减毒鼠伤寒沙门菌LB5000进行甲基化修饰，筛选氨卞西林抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，进一步电击转化终宿主菌SL7207，挑取抗性克隆于含100ug/ml氨卞西林LB培养液扩增后将得到的蛋白纯化制成的幽门螺杆菌疫苗。本发明专利技术提供的含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的新疫苗，是UreB、CagA蛋白共同免疫使免疫效力达到一个更高的水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术的实施方式涉及生物医学
，具体涉及ー种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法。
技术介绍
目前已经确认幽门螺杆菌(helicobacter pylori,H.Pylori,Hp)与上消化道疾病中的ー些疾病密切相关，包括胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌。幽门螺杆菌全菌有非常复杂的抗原成分，此菌菌种保存不易、生产周期长、产量低、易受污染。随着分子生物学的发展，人们迅速投入了对 Hp各种特殊基因的研究，已成功克隆了十多种Hp不同的基因组或基因，其中包括趋化因子CheA和cheY、细胞毒素相关基因cagA和cagC、鞭毛素基因fIaA和flaB、热休克蛋白质基因hspA、空泡毒素基因vacA、尿素酶基因ureA、ureB、ureC、修复基因recA、空泡韋素基因vacA、喊性憐酸酶基因组等。目如已发现重组的尿素酶、热休克蛋白、细胞毒素相关蛋白、空泡毒素、黏附素等亚单位蛋白或融合蛋白均可以作为免疫原刺激机体产生保护性免疫反应。此外还发现幽门螺杆菌核酸疫苗也存在重要的免疫保护性。细胞毒素相关蛋白(CagA) :CagA是ー种亲水性免疫显性蛋白，免疫原性强，是Hpcag毒力岛的标志，相对分子质量为120000 140000，位于细菌表面，与消化性溃疡、萎缩性胃炎及胃癌的发生密切相关，能刺激胃上皮细胞分泌IL-8，促进粒细胞在胃黏膜中聚集，从而发生严重的炎症反应。cagA基因5’端高度保守，3’端区域含有数目可变的谷氨酸-脯氨酸-异亮氨酸-酪氨酸-丙氨酸(EPIYA)重复序列，CagA大小的变化与cagA基因3’端存在的重复序列有关。Ghiara、han、黄琢等对cagA基因做了许多研究，包括克隆cagA基因、在大肠杆菌中表达重组的cagA，将表达蛋白免疫小鼠。结果酶联免疫吸附试验(ELISA)证明表达的蛋白都具有強弱不等的抗原性，不仅成功清除了小鼠胃内的Hp，而且有效保护小鼠免遭Hp的再感染，可见重组的CagA全长或片段都有较强的免疫原性，是幽门螺杆菌疫苗的首选抗原之一 O尿素酶及其亚单位(ureA、ureB、ureC等)是幽门螺杆菌的定植因子和毒力因子，为幽门螺杆菌在胃内生存的必要条件。研究表明所有幽门螺杆菌菌株均能产生尿素酶，井且序列高度保守，表达量高。尿素酶ー组基因位于4. 2kb的DNA片段中，有4个开放读码框(ORFs)，编码相对分子量分别为26 500 (尿素酶A亚单位，UreA)、61 600 (尿素酶B亚单位，UreB)、49 200 (尿素酶C亚单位，UreC)、15 000 (尿素酶D亚单位，UreD)的多肽。A和B两个亚单位是主要的功能单位，以I :1的比例构成ー个基本的酶分子，UreC和UreD的功能目前还不清楚，可能为调节基因。其中以B亚单位抗原性和保护作用最強，是幽门螺杆菌免疫防治的主要候选疫苗之一。研究表明，单ー的幽门螺杆菌抗原免疫水平低，但多种抗原成分联合免疫可以提高免疫性，可使100%的小鼠避免幽门螺杆菌感染。姜政、朱森林等成功克隆并融合表达了Hp的hsp和外膜蛋白,Western印迹法检测显示重组蛋白有良好的免疫原性,构建了 UreB/hpaA双价抗幽门螺杆菌活疫苗。
技术实现思路
本专利技术克服了现有单ー幽门螺杆菌基因疫苗免疫水平低的不足，提供ー种幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白联合免疫的基因疫苗的制备方法，以达到提高免疫性，避免幽门螺杆菌的感染的目的。为解决上述的技术问题，本专利技术的一种实施方式采用以下技术方案 本专利技术提供了一种幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白疫苗的制备方法，其具体步骤如下以EcoR I、Pst I分别正向酶切重组质粒pUC-ureB及pUC-cagA,经I. 0%琼脂糖凝胶电泳割胶回收目的片段，连接并转化，挑取抗性克隆扩增，抽提质粒，得到pUC-ureB-cagA,酶切鉴定。 采用氯化钙法将表达载体PlRES转化受体菌DH5a感受态细胞，筛选氨卞西林抗性菌落选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，得到PIRES。分别将抽提所得pIRES及重组质粒pUC-ureB-cagA双酶切，所使用的两种酶为EcoR I ,Pst I，然后将酶切产物分别进行O. 8%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段。将pUC-ureB-cagA 经双酶切所得的 ureB-cagA 片段插入 pIRES 的 EcoR I、Pst I切点。获得连接产物pIRES-ureB-cagA。将连接产物全部转化受体菌DH5a的感受态细胞，筛选氨卞西林抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切鉴定；以抽提质粒为模板，ureB上游引物及cagA下游引物为ー对引物PCR扩增目的片段。将pIRES-ureB-cagA化学转化活减毒鼠伤寒沙门菌LB5000进行甲基化修饰，筛选氨卞西林抗性菌落，选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒，进ー步电击转化终宿主菌SL7207,挑取抗性克隆于含100ug/ml氨卞西林LB培养液扩增60代，每10代抽提质粒进行PCR及双酶切鉴定，得到蛋白质和寡核苷酸的混合物。采用SDS-PAGE分离上述所得蛋白质和寡核苷酸；SDS_PAGE使用12%的分离胶和4%的积层胶。使用缓冲液B洗涤上述所得蛋白质后分别用浓度为2mol/l、4mol/l、6mol/l、8mol/l尿素变性缓冲液溶解包涵体。采用亲和层析洗脱部分杂质蛋白，使表达蛋白初纯化。制备小鼠抗血清初纯化蛋白SDS-PAGE后，以去离子水洗胶，然后以O. 05%考马斯亮兰R-250水溶液染胶30分钟，继续以去离子水洗胶，反复几次至目的蛋白条带变白。割下蛋白条带磨碎后加入Iml PBS，皮下注射小鼠，两周后再予以皮下注射加强免疫。加强免疫一周后收集小鼠内侧眼窝血液，制备血清。与现有技术相比，本专利技术的有益效果之一是本专利技术提供的含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的新疫苗，不是UreB蛋白和CagA蛋白単独免疫时免疫效カ相加的和，而是UreB、CagA蛋白共同免疫使免疫效カ达到一个更高的水平，解决了目前幽门螺杆菌基因疫苗免疫水平低的问题。具体实施例方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，对本专利技术进行进一歩详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用干限定本专利技术。I融合基因ureB-cagA的构建及鉴定以EcoR I、Pst I分别正向酶切重组质粒pU C-ureB及pUC-cagA,割胶回收目的片段，连接并转化，挑取抗性克隆扩增，抽提质粒，得到pUC-ureB-cagA,酶切鉴定。I. I酶切重组质粒Positive pUC-ureB or pi 1C- cagA Plasmid4ul 10 X Buffer B2 Li I [coR I0.5ul Pst I0.5ul ddH2013ul37°C酶切I小时，2ul IOxLoadding Buffer终止反应，I. 0%琼脂糖凝胶电泳I. 2重组质粒pIRES-ureB-cagA的构建及鉴定(亚克隆)I. 2. IpIRES的扩增和抽提 采用氯化钙法将表达载体pIRES转化受体菌DH5a感受态细胞，筛选氨卞西林抗性菌落选择性扩增，碱裂解法小量抽提质粒。I. 2. 2pI本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种含幽门螺杆菌UreB、CagA蛋白的基因疫苗的制备方法，其特征在于通过基因工程技术重组质粒pIRES-ureB-cagA，并将其扩增、修饰、转化、筛选后电击转化到终宿主菌SL7200中表达UreB、CagA蛋白进行联合免疫而制备得到的基因疫苗。2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述重组质粒pIRES-ureB-cagA由表达载体PlRES和重组质粒pUC-ureB-cagA经双酶切重组构建。3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述扩增是指重组质粒pIRES-ureB-cagA以ureB上游引物及cagA下游引物为ー对引物的PCR扩增。4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述修饰是重组质粒pIRES-ureB-cagA转化活减毒鼠伤寒沙门菌L...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯文礼，蔡勇，钟泽荣，冯晓，
申请(专利权)人：成都康华生物制品有限公司，
类型：发明
国别省市：
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