一种多重荧光制造技术

本申请涉及一种多重荧光

【技术实现步骤摘要】
一种多重荧光PCR检测微卫星不稳定状态试剂盒


[0001]本申请涉及一种试剂盒，尤其是涉及一种多重荧光
PCR
检测微卫星不稳定状态试剂盒
。

技术介绍

[0002]微卫星
(Microsatellite
，
MS)
序列，是一些短而重复的
DNA
序列，一般由1～6个核苷酸组成，串联重复排列，常见类型为双碱基
CA/GA/GT
或单碱基
A/T
等
。MS
序列位于基因的重要非编码区，也可以位于基因的编码区，多态性分布于整个基因组，约占基因组3％
。
微卫星不稳定性
(Microsatellite Instability
，
MSI)
是由于在
DNA
复制时插入或缺失突变引起的微卫星
(MS)
序列长度改变的现象，常由错配修复功能
(Mismatch repair
，
MMR)
缺陷引起
。MSI
现象于
1993
年在结直肠癌中首次发现，随后在子宫内膜癌
、
胃癌
、
卵巢癌等实体瘤中均有发生
MSI
现象
。MSI
是
Lynch
综合征的特征性分子，约
90
％以上表现出
MSI。
如果
MSI
检测位点选择出现偏差，将直接影响微卫星高度不稳定
(MSI
‑
H)
患者的检出率，选择错误会大大增加漏诊率，会影响到千万个肿瘤患者的生命
。
目前国际公认的是
「2B3D」panel
，如果检测位点尚未经过人群验证，可能会造成假阴性或假阳性的结果
。
[0003]目前国际上
MSI
检测试剂盒是基于单核苷酸
Panel
位点的检测，如
promega
开发的5个单核苷酸的
Panel(Bat
‑
25、Bat
‑
26、NR
‑
21、NR
‑
24、MONO
‑
27)。
我国
2021
年胃癌指南的
MSI
位点选择非常明确，5个位点的
Panel(2B3D
的
NCI Panel
和5个单核苷酸的
Panel)
，同年，
《
结直肠癌分子检测高通量测序专家共识
》
建议采用
NCI
推荐的
2B3D
位点
。
中国人群使用
2B3D NCI Panel
比单核苷酸
Panel
多检出近
30
％的
MSI
‑
H
肿瘤，因此，
2B3D NCI Panel
在中国人群中的广泛使用可避免
MSI
‑
H
肿瘤的漏检
。
无论是哪种
Panel
，检测方法均为多重荧光
PCR+
毛细管电泳
。
[0004]目前国内只有一款基于
2B3D
的检测试剂盒，但只有一个
PentaC
的对照位点，其不足的地方在于一个对照位点不足以判断潜在的样品加错
、
样品污染
。
因为在多数情况下，对照位点的产物个数和大小一致
(
片段大小差异小于
0.5nt)
；少数情况下，由于样本存在微卫星不稳定，对照位点可能会表现不稳定，因此需要引入至少2个对照位点来核实检测样本是否为同一个体
。

技术实现思路

[0005]为了解决以上技术问题，本申请提供了一种多重荧光
PCR
检测微卫星不稳定状态试剂盒，本申请除了
2B3D
位点和
Penta D
对照位点外，还包含了性别位点，更加保障了检测的准确性
。
[0006]本申请的技术方案如下：一种多重荧光
PCR
检测微卫星不稳定状态试剂盒，包括如下引物：第一标志物，
Bat
‑
25
，包含
25
个连续
T
的同聚物重复，其基因编号为
X06182
，
s
上下游引物为：
Bat
‑
25
‑
F
：5’
GGGAGTGATTCTCTAAAGAG 3
’
(SEQ ID No.1)
；
Bat
‑
25
‑
R
：5’
TGACATTCTGCATTTTAACTATGG 3
’
(SEQ ID No.2)
；第二标志物，
Bat
‑
26
，包含
26
个连续
A
的同聚物重复，其基因编号为
U04045
，上下游引物为：
Bat
‑
26
‑
F
：5’
GACTTCAGCCAGTATATGAAAT 3
’
(SEQ ID No.3)
；
Bat
‑
26
‑
R
：5’
CTTCAGTATATGTCAATGAAAACATT 3
’
(SEQ ID No.4)
；第三标志物：
D2S123
，包含
15
个连续的
CA
同聚物重复，其基因编号为
Z16551.1
，上下游引物为：
D2S123
‑
F
：5’
GCCTTTAACAGTGCTATTCAAC 3
’
(SEQ ID No.5)
；
D2S123
‑
R
：5’
ACCTATGGGACTGTGCATCTA 3
’
(SEQ ID No.6)
；第四标志物：
D5S346
，包含
26
个连续的
CA
同聚物重复，其基因编号为
M73547.1
，上下游引物为：
D5S346
‑
F
：5’
TGGCATATGAATACCAGGATAG 3
’
(SEQ ID No.7)
；
D5S346
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种多重荧光
PCR
检测微卫星不稳定状态试剂盒，其特征在于，包括如下引物：第一标志物
Bat
‑
25
的上下游引物
Bat
‑
25
‑
F
：5’‑
GGGAGTGATTCTCTAAAGAG
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.1
所示；
Bat
‑
25
‑
R
：5’‑
TGACATTCTGCATTTTAACTATGG
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.2
所示；第二标志物
Bat
‑
26
的上下游引物
Bat
‑
26
‑
F
：5’‑
GACTTCAGCCAGTATATGAAAT
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.3
所示；
Bat
‑
26
‑
R
：5’‑
CTTCAGTATATGTCAATGAAAACATT
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.4
所示；第三标志物
D2S123
的上下游引物
D2S123
‑
F
：5’‑
GCCTTTAACAGTGCTATTCAAC
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.5
所示；
D2S123
‑
R
：5’‑
ACCTATGGGACTGTGCATCTA
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.6
所示；第四标志物
D5S346
的上下游引物
D5S346
‑
F
：5’‑
TGGCATATGAATACCAGGATAG
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.7
所示；
D5S346
‑
R
：5’‑
CTAGTTTTTCAGGGAATTGAGAG
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.8
所示；第五标志物
D17S250
的上下游引物
D17S250
‑
F
：5’‑
GAAAAAAGTAAGCATAAAAAGGAAG
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.9
所示；
D17S250
‑
F
：5’‑
GCTGGCCATATATATATTTAAACC
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.10
所示；对照位点
PentaD
的上下游引物
PentaD
‑
F
：5’‑
CCAGGCATGGTGAGGCTG
‑3’
，碱基序列如
SEQIDNo.11
所示；
PentaD
‑
R
：5’‑
TGATTCTCTTTTTTTCCCCTTCG
‑3’
，碱基序列如
S...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁漫飞，赵庆友，赵屹，杨飞，高昂，徐涛，
申请(专利权)人：济南市中心医院，
类型：发明
国别省市：