基于双扩增放大和双制造技术

本发明专利技术涉及

【技术实现步骤摘要】
基于双扩增放大和双LNA探针特异识别DNA突变的高灵敏检测方法


[0001]本专利技术涉及
DNA
序列检测领域，尤其是涉及基于双扩增放大和双
LNA
探针特异识别
DNA
突变的高灵敏检测方法
。

技术介绍

[0002]准确
、
快速
、
灵敏的分析
DNA
序列对于癌症和传染病的诊断和临床管理至关重要
。
例如，表皮生长因子受体
(epidermal growth factor receptor
，
EGFR)
蛋白是表皮生长因子家族成员，是一类在细胞信号转导和调控方面发挥重要作用的跨膜蛋白，与细胞增殖
、
分化和转移息息相关
。
研究表明，
EGFR
基因敏感突变与非小细胞肺癌
(non
‑
small cell lung cancer
，
NSCLC)
的临床转归密切相关<br/>。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
基于双扩增放大和双
LNA
探针特异识别
DNA
突变的高灵敏检测方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一：设计跨越突变位点的引物，根据
DNA
序列信息，设计一对跨越突变位点的引物，突变序列及相应的野生序列在该引物的作用下进行
RPA
反应以实现无差别的预富集，预富集完成后，混合序列由双
LNA
探针进行识别；步骤二：建立碱基序列验证模板，根据突变位点的碱基序列信息，通过
PCR
技术制备
100%
突变序列和野生型序列，并通过琼脂糖电泳凝胶及测序确定所制备序列长度符合预期，碱基序列准确可用；步骤三：建立方法的检测流程，在冰上按试剂说明书对反应组分进行预组装，其中组分
A
为
RPA
反应相关组分，
RPA
反应相关组分包括引物
F/R、Rehydration buffer、
酶混合物
、
醋酸镁以及待测样本，组分
B
为
LNA Clamp PCR
反应相关组分，
LNA Clamp PCR
反应相关组分包括引物
F/R、Taqman LNA
探针
、
抑制性
LNA
探针
、qPCR Mix(Probe
法）以及
ROX
参比荧光，分别完成组分
A
和
B
的预组装后，向组分
A
中加入待测
DNA
，混匀后依次将组分
B、
组分
A
分别添加至八连管的管盖和管底，在
39℃
下进行
30min
的
RPA
反应，随后离心使
B
组分进入反应体系并开始后续改良的
20
个循环的
LNA Clamp PCR
反应，通过
ABI 7500
仪器实时监测荧光变化；步骤四：分析待测样本的实时荧光值，将检测到的荧光值减去第一个测量的荧光值以进行背景校正和标准化分析，并将差值定义为荧光增量
Δ
Rn,
同时检测
12
个无模板对照样本，计算其
Δ
Rn
的平均值和标准差，将平均值＋3倍标准差四舍五入至整数作为结果判定的阈值（
cut
‑
off
值）；步骤五：检测临床样本的潜力，制备血浆浓度为
0%
，
25%
，
50%
的模拟临床样本，该样本中均含
100 copies/ul
的突变型序列，利用新建方法对上述样本进行检测，对各组样本荧光差值进行学生
t
检验，通过
P
值判定血浆是否对检测效果有抑制作用
。2.
根据权利要求1所述的基于双扩增放大和双
LNA
探针特异识别
DNA
突变的高灵敏检测方法，其特征在于，在所述步骤一中，双探针包括
TaqMan LNA

【专利技术属性】
技术研发人员：李金明，张瑞，黄滔，韩彦熙，
申请(专利权)人：北京医院，
类型：发明
国别省市：