基于双扩增放大和双制造技术

本发明专利技术涉及

【技术实现步骤摘要】
基于双扩增放大和双LNA探针特异识别DNA突变的高灵敏检测方法


[0001]本专利技术涉及
DNA
序列检测领域，尤其是涉及基于双扩增放大和双
LNA
探针特异识别
DNA
突变的高灵敏检测方法
。

技术介绍

[0002]准确
、
快速
、
灵敏的分析
DNA
序列对于癌症和传染病的诊断和临床管理至关重要
。
例如，表皮生长因子受体
(epidermal growth factor receptor
，
EGFR)
蛋白是表皮生长因子家族成员，是一类在细胞信号转导和调控方面发挥重要作用的跨膜蛋白，与细胞增殖
、
分化和转移息息相关
。
研究表明，
EGFR
基因敏感突变与非小细胞肺癌
(non
‑
small cell lung cancer
，
NSCLC)
的临床转归密切相关
。
其中
EGFR T790M
突变是
EGFR
酪氨酸激酶抑制剂靶向治疗的患者耐药性产生的最主要原因
。
对于
EGFR T790M
突变阳性的晚期
NSCLC
患者，可优先选用第三代
EGFR
‑
TKIs
药物进行治疗
。
准确获取
DNA<br/>序列突变的信息不仅对肿瘤的疗效判断和治疗方案的制订有重要意义，还在病原体耐药性的产生
、
人类疾病的遗传等多个临床领域发挥重要作用
。
因此，建立
DNA
的快速可靠的检出策略，有助于更好的应对公共卫生和传染病防疫挑战
、
为肿瘤患者制定个体化精准治疗方案等，提高疾病预防及监测预警能力，助力全面实现“健康中国
2030”规划
。
[0003]DNA
突变的检测对方法学的特异性和敏感性提出了更高的要求，然而，目前尚缺乏一种不损失敏感性和特异性的快速检测平台
。
首先，
DNA
突变涉及单个碱基水平的变化，对方法学特异性要求高
。
其次，以液体活检为例，癌症特异性突变的丰度通常在
0.01
％～
10
％之间变化，具体取决于疾病分期和患者特异性疾病特征
。cfDNA
突变可能具有低突变丰度，这是由于疾病处于早期阶段并且肿瘤质量很小，或者亚克隆突变仅存在于肿瘤细胞的一个子集中
。
亚克隆突变对于治疗选择尤为重要，因为具有耐药突变的罕见亚克隆可在治疗时扩增导致快速治疗失败
。
因此，在临床环境中，实现
0.1
％或更低的突变变异分数检测限至关重要，这便要求检测方法学具有极低的容错率和极高的特异性识别能力
。
目前临床使用较广泛的如
ARMS
‑
PCR
技术
、
高分辨率熔解曲线
(high
‑
resolution melting)
分析
、Sanger
测序等方法敏感性较差，且反应时间较长
。CRISPR
技术亦常与
PCR
技术或等温扩增技术相结合以提高方法学的特异性和敏感性，但其未能很好的解决这一问题，对原始样本中低拷贝数的靶标仍存在漏检的情况，且
CRISPR
系统固有的脱靶效应还给高特异性的
DNA
突变的检出带来了新的不确定性，此外其仅能识别特定位点中的突变，具有较强的序列限制性
。
新材料的使用为突变的检测带来了快速的优势，如金纳米技术可以辅助
DNA
突变的快速检测，但其仅在突变型序列和野生型序列比例为1：1的样本上进行了验证，不能检测更高背景序列的样本
。
二代测序亦在
DNA
点突变检测中有所应用，但受限于复杂的湿实验过程和生物信息学分析
。
[0004]多反应的级联可实现不同优势的有机整合
。LNA Clamp PCR
反应通过将
LNA
探针引入到
PCR
反应中以提高特异性，但抑制背景序列扩增的同时会在一定程度上抑制突变型序
LNA
探针与突变型序列结合，在
Taq
聚合酶5’→3’
切刻活性的作用下发出荧光信号从而被检出，而抑制性
LNA
探针则与野生型序列结合，阻滞其检出
。
[0014]优选的，在所述步骤一中，鉴于
RPA
反应与
Taq
聚合酶5’→3’
切刻活性的不兼容，本专利技术采用物理分离的策略建立单管反应，其中
RPA
反应是小体积的，避免二次混匀的需求
。
[0015]优选的，在所述步骤一中，鉴于
RPA
反应多需要在反应开始的3～6分钟进行二次混匀以实现性能的最大化，此需求与物理分离策略不兼容，故本专利技术采用小体积
(5ul)
的
RPA
反应，在不需二次混匀的情况下实现同等的性能
。
[0016]优选的，在所述步骤三中，采用控制变量法，分别对醋酸镁浓度
、TaqMan LNA
探针与
LNA
抑制性探针的浓度比等参数进行优化，其中最佳醋酸镁浓度为
28mM
，
TaqMan LNA
探针与
LNA
抑制性探针的最佳浓度比为1：
3。
[0017]优选的，在所述步骤四中，检测
12
个无模板对照样本，将其检测结果的均值加上三倍标准差作为检测的阈值，分析特异性评估采用新建方法对野生型样本进行检测，高于该值则判定为阳性，低于该值则判定为阴性，样本检测时至少进行三次技术重复
。
[0018]优选的，在所述步骤四中，分析敏感性评估利用新建方法对基因突变样本进行检测，每个样本检测
20
次，用
Medcalc
软件对检测结果进行
Probit
分析，以
95
％置信区间对应的浓度作为方法学检测下限，该方法可检测单拷贝的
DNA
样本，对
0.007
％突变的样本进行选择性识别
。
[0019]优选的，在所述步骤五中，制备血浆浓度为
50
％，变异等位基因分数为0％～
10
％不等的模拟临床样本
20
例，并将其进行0～
20
的随机编号，由另一操作人员利用本专利技术中新建方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
基于双扩增放大和双
LNA
探针特异识别
DNA
突变的高灵敏检测方法，其特征在于，包括下述步骤：步骤一：设计跨越突变位点的引物，根据
DNA
序列信息，设计一对跨越突变位点的引物，突变序列及相应的野生序列在该引物的作用下进行
RPA
反应以实现无差别的预富集，预富集完成后，混合序列由双
LNA
探针进行识别；步骤二：建立碱基序列验证模板，根据突变位点的碱基序列信息，通过
PCR
技术制备
100%
突变序列和野生型序列，并通过琼脂糖电泳凝胶及测序确定所制备序列长度符合预期，碱基序列准确可用；步骤三：建立方法的检测流程，在冰上按试剂说明书对反应组分进行预组装，其中组分
A
为
RPA
反应相关组分，
RPA
反应相关组分包括引物
F/R、Rehydration buffer、
酶混合物
、
醋酸镁以及待测样本，组分
B
为
LNA Clamp PCR
反应相关组分，
LNA Clamp PCR
反应相关组分包括引物
F/R、Taqman LNA
探针
、
抑制性
LNA
探针
、qPCR Mix(Probe
法）以及
ROX
参比荧光，分别完成组分
A
和
B
的预组装后，向组分
A
中加入待测
DNA
，混匀后依次将组分
B、
组分
A
分别添加至八连管的管盖和管底，在
39℃
下进行
30min
的
RPA
反应，随后离心使
B
组分进入反应体系并开始后续改良的
20
个循环的
LNA Clamp PCR
反应，通过
ABI 7500
仪器实时监测荧光变化；步骤四：分析待测样本的实时荧光值，将检测到的荧光值减去第一个测量的荧光值以进行背景校正和标准化分析，并将差值定义为荧光增量
Δ
Rn,
同时检测
12
个无模板对照样本，计算其
Δ
Rn
的平均值和标准差，将平均值＋3倍标准差四舍五入至整数作为结果判定的阈值（
cut
‑
off
值）；步骤五：检测临床样本的潜力，制备血浆浓度为
0%
，
25%
，
50%
的模拟临床样本，该样本中均含
100 copies/ul
的突变型序列，利用新建方法对上述样本进行检测，对各组样本荧光差值进行学生
t
检验，通过
P
值判定血浆是否对检测效果有抑制作用
。2.
根据权利要求1所述的基于双扩增放大和双
LNA
探针特异识别
DNA
突变的高灵敏检测方法，其特征在于，在所述步骤一中，双探针包括
TaqMan LNA

【专利技术属性】
技术研发人员：李金明，张瑞，黄滔，韩彦熙，
申请(专利权)人：北京医院，
类型：发明
国别省市：