用于目标等位基因多态性位点扩增制造技术

本发明专利技术公开了用于目标等位基因多态性位点扩增

【技术实现步骤摘要】
用于目标等位基因多态性位点扩增、检测的方法和试剂


[0001]本专利技术属于等位基因多态性检测
，具体涉及一种用于目标等位基因多态性位点扩增
、
检测的方法和试剂
。

技术介绍

[0002]等位基因多态性
(Allelic Polymorphism,AP)
广泛存在于各物种基因组中并与各种性状相关联，可广泛用于遗传疾病诊断
、
药物开发使用
、
作物育种以及品种纯度鉴定等领域
。
等位基因多态性检测中，一般通过
PCR
手段对多态性位点进行富集，再结合其他手段对富集产物进行检测
。AS
‑
PCR
是等位基因多态性检测的主要技术手段，其关键是在多态性位点处设计引物，该引物3’
端的碱基与多态性位点的特定基因型互补，当且仅当存在该基因型时，引物才可匹配并延伸
。
可在前述引物上设计与荧光探针互补的标签序列，将特定基因型与特定荧光信号对应，即可通过检测荧光信号确定多态性位点是否存在并进一步确定多态性位点基因型
。
[0003]使用基于荧光信号的
AS
‑
PCR
进行等位基因多态性检测，具有准确
、
快速
、
高通量
、
低成本
、
无污染
、
设备要求低及易操作的优势
。
但在实际应用中，仍会出现非特异扩增，干扰多态性的判定
。
以基于荧光信号的
AS
‑
PCR
检测为例进行具体说明
。
图1为根据检出结果绘制的等位基因分型示意图，各坐标轴数值为荧光信号相对值，即探针所带荧光基团释放的荧光信号绝对值与背景荧光信号绝对值的倍数，灰色圆点所示为阴性对照
。
对于一个等位基因多态性位点
G/A
，设计基因型
G
使用
FAM
荧光检测
(
对应
X
轴，
FAM
荧光信号相对值
)、
基因型
A
使用
HEX
荧光检测
(
对应
Y
轴，
HEX
荧光信号相对值
)。
理论上，
GG
纯合样本检出信号应落在
X
轴上或附近
(
图中
D
所示
)
，但在实际检测中，其信号值会偏离
X
轴
(
图中
C
所示
)
，其原因在于非特异性扩增导致检出
HEX
信号造成该纯合样本检测信号的偏移
。
同理，理论上
AA
纯合样本检出信号应落在
Y
轴上或附近
(
图中
A
所示
)
，但在实际检测中，其信号值会偏离
Y
轴
(
图中
B
所示
)。
因此，纯合基因型检测信号相对坐标轴的偏离程度可以反应
PCR
扩增的特异性
。
此外，对于杂合基因型
GA
，其检测信号位于两种纯合基因型信号之间
。
也就是说，如果非特异性扩增较强，势必会对分型判断造成影响
。
[0004]另外，现有技术的各种等位基因多态性检测方法通常对核酸样本的要求较高，与利用粗提法获取的核酸样本兼容性有限
。
使用核酸粗提液进行检测通常会导致等位基因多态性分型结果变差甚至无法分型
。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中等位基因多态性检测存在的非特异扩增和核酸样本要求高的问题，本专利技术旨在建立一种用于等位基因多态性位点扩增方法，并利用该方法实现等位基因多态性的特异性
、
高灵敏度检测
。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0007]本专利技术第一方面提供了一种用于目标等位基因多态性位点的扩增方法，具体为：
利用样本核酸
、
第一引物
、
第二引物和第三引物进行扩增反应，且至少发生以下三种扩增反应：
[0008]反应一，第一引物和第二引物以样本核酸为模板扩增得到第一产物，第一产物为包含目标等位基因多态性位点的片段；
[0009]反应二，第二引物和第三引物以样本核酸或
/
和第一产物为模板扩增得到第二产物，第三引物包括5’
部分
、
中间部分和3’
部分，其中5’
部分和3’
部分分别与模板互补配对，3’
端位于目标等位基因多态性位点处，且中间部分包含标签序列；
[0010]反应三，第一引物和第四引物以样本核酸或
/
和第一产物为模板扩增得到第三产物，其中第四引物为第二产物变性所得的与第一引物方向相对的单链
。
[0011]优选地，还发生有以下扩增反应：反应四，第一引物和第二引物以第三产物为模板扩增获得第三产物
。
[0012]优选地，所有反应在同一反应体系中进行
。
[0013]在本专利技术的扩增方法中，所述样本核酸可以为基因组
DNA、
质粒
DNA、DNA
片段
、RNA、DNA
或
RNA
类似物
、DNA
或
RNA
修饰衍生物等
。
其中，基因组
DNA
包括核基因组
、
细胞器基因组；
DNA
片段可通过各种技术手段获得，例如通过物理方法
、
酶切方法将基因组
DNA
打断获得
DNA
片段，又如通过
PCR
扩增
、
探针捕获富集特定
DNA
片段
。
样本核酸的原始形态不做限制，例如单链核酸
、
双链核酸，又如线性核酸
、
环状核酸
。
样本核酸的来源不做限制，包括但不限于动物
(
人及其他动物
)、
植物
、
细菌
、
真菌
、
病毒
。
可采取本领域已知的方法对样本核酸进行分离
、
抽提，特别的可使用粗提法对核酸进行分离
、
抽提，例如可采取碱煮法
、
酶解法
、SDS
法
、CTAB
法
、
酚抽提法...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种用于目标等位基因多态性位点的扩增方法，其特征在于，利用样本核酸
、
第一引物
、
第二引物和第三引物进行扩增反应，且至少发生以下三种扩增反应：反应一，第一引物和第二引物以样本核酸为模板扩增得到第一产物，第一产物为包含目标等位基因多态性位点的片段；反应二，第二引物和第三引物以样本核酸或
/
和第一产物为模板扩增得到第二产物，所述第三引物包括5’
部分
、
中间部分和3’
部分，其中5’
部分和3’
部分分别与模板互补配对，3’
端位于目标等位基因多态性位点处，且中间部分包含标签序列；反应三，第一引物和第四引物以样本核酸或
/
和第一产物为模板扩增得到第三产物，其中第四引物为第二产物变性所得的与第一引物方向相对的单链
。2.
根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，还发生有以下扩增反应：反应四，第一引物和第二引物以第三产物为模板扩增获得第三产物
。3.
根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述各反应在同一反应体系中进行
。4.
根据权利要求1所述的扩增方法，其特征在于，所述第三引物与模板互补配对后形成凸环
、
茎环或非对称内环结构
。5.
根据权利要求3所述的扩增方法，其特征在于，所述反应一的退火温度高于反应二的扩增温度
。6.
一种用于目标等位基因多态性位点的检测方法，其特征在于，利用权利要求1～5任一项所述的扩增方法得到第...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭超，杨燕宇，韦懿，
申请(专利权)人：武汉市景肽生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：