一种基于制造技术

本发明专利技术涉及一种基于

【技术实现步骤摘要】
的作用
。
研究发现，
splintR DNA
连接酶对于以
RNA
为夹板的
DNA
末端连接具有很高的活性，比
T4 DNA
连接酶的连接效率要高很多
。
因此，出现了直接以
RNA
为连接探针进行
RNA
序列检测的技术
。
但是，
splintR DNA
连接酶的碱基特异性识别能力较差，这导致直接以
RNA
为靶标的
SNP
检测技术受到限制
。
因此，开发一种简单
、
经济且特异性好的直接以
RNA
为检测靶标进行
SNP
基因分型的方法很有意义
。

技术实现思路

[0009]为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于
FQ
‑
RCA
的
RNA
等温实时基因分型试剂盒，所述试剂盒的成分包含锁式探针
(Padlock probe)
杂交试剂
、
锁式探针环化试剂
、
滚环扩增引物杂交试剂
、
滚环扩增试剂
、
检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂；所述锁式探针杂交试剂的成分包含第一锁式探针和第二锁式探针；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型
RNA
模板和突变型
RNA
模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分包含
splintR DNA
连接酶；所述
splintR DNA
连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分包含滚环扩增引物；所述滚环扩增引物能够分别与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂用于将第一环化产物和第二环化产物滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分包含第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；所述淬灭探针杂交试剂的成分包含淬灭探针；所述淬灭探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第一检测探针产生的信号；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第二检测探针产生的信号
。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述第一锁式探针与野生型
RNA
模板完全匹配；所述第二锁式探针与突变型
RNA
模板完全匹配
。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述滚环扩增引物能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针互补配对，进而与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，最终引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增
。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述滚环扩增试剂的成分包含
dNTP
和
DNA
聚合酶；所述
dNTP
能够在
DNA
聚合酶的作用下进行第一环化产物和第二环化产物的滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物
。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述
DNA
聚合酶为
phi29 DNA
聚合酶
。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述第一检测探针和第二检测探针上分别偶联有第一荧光标记物和第二荧光标记物；所述淬灭探针上偶联有荧光淬灭标记物；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；所述淬灭探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述第一荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述第二荧光标记物的荧光信号会被荧光淬灭标记物淬灭
。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述第一荧光标记物包括
VIC
荧光基团
、FAM
荧光基团
、HEX
荧光基团或
JOE
荧光基团；所述第二荧光标记物包括
VIC
荧光基团
、FAM
荧光基团
、HEX
荧光基团或
JOE
荧光基团；所述荧光淬灭标记物包括
BHQ
淬灭基团
、MGB
淬灭基团或
Dabcyl
淬灭基团
。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述第一锁式探针和第二锁式探针的5’
端修饰有磷酸基团
。DNA
序列5’
端一般为羟基
(
‑
OH)
，而连接酶是将5’
端的磷酸基团
(5
’‑
P)
与3’
端的羟基基团
(3
’‑
OH)
进行连接形成磷酸二酯键，因此需要将挂锁探针的5’
端进行磷酸化修饰，才能让其连接成环
。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述滚环扩增引物的3’
端设置有两个或三个碱基的硫代修饰
。
两个碱基的硫代修饰能够有效防止滚环扩增引物被
phi29DNA
聚合酶的外切酶活性酶切
。
三个碱基的硫代修饰能够完全防止滚环扩增引物被
phi29 DNA
聚合酶的外切酶活性酶切
。
[0018]在本专利技术的一种实施方式中，所述第一检测探针的3’
端修饰有
VIC
荧光基团；所述第二检测探针的3’
端修饰有
FAM
荧光基团；所述淬灭探针的5’
端修饰有
BHQ
淬灭基团，3’
端修饰有磷酸基团
。
[0019]在本专利技术的一种实施方式中，所述锁式探针杂交试剂的成分由第一锁式探针和第二锁式探针组成；所述锁式探针环化试剂的成分由
splintR DNA
连接酶组成；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分由滚环扩增引物组成；所述滚环扩增试剂的成分由
dNTP
和
DNA
聚合酶组成；所述检测探针杂交试剂的成分由第一检测探针和第二检测探针组成；所述淬灭探针杂交试剂的成分由淬灭探针组成
。
[0020]在本专利技术的一种实施方式中，所述试剂盒的成分还包含
splintR DNA
连接酶缓冲液
、ExoⅠ、RNas本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种基于
FQ
‑
RCA
的
RNA
等温实时基因分型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的成分包含锁式探针杂交试剂
、
锁式探针环化试剂
、
滚环扩增引物杂交试剂
、
滚环扩增试剂
、
检测探针杂交试剂和淬灭探针杂交试剂；所述锁式探针杂交试剂的成分包含第一锁式探针和第二锁式探针；所述第一锁式探针和第二锁式探针能够分别与野生型
RNA
模板和突变型
RNA
模板特异性结合，形成第一杂合体和第二杂合体；所述锁式探针环化试剂的成分包含
splintR DNA
连接酶；所述
splintR DNA
连接酶能够将第一杂合体和第二杂合体环化，形成第一环化产物和第二环化产物；所述滚环扩增引物杂交试剂的成分包含滚环扩增引物；所述滚环扩增引物能够分别与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，进而引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增；所述滚环扩增试剂用于将第一环化产物和第二环化产物滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物；所述检测探针杂交试剂的成分包含第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；所述淬灭探针杂交试剂的成分包含淬灭探针；所述淬灭探针能够分别与第一环状扩增产物和第二环状扩增产物特异性结合；当淬灭探针与第一检测探针共同结合在第一环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第一检测探针产生的信号；当淬灭探针与第二检测探针共同结合在第二环状扩增产物上时，所述淬灭探针能够淬灭第二检测探针产生的信号
。2.
如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述滚环扩增引物能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针互补配对，进而与第一环化产物和第二环化产物特异性结合，最终引发以第一环化产物和第二环化产物为模板的滚环扩增
。3.
如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述滚环扩增试剂的成分包含
dNTP
和
DNA
聚合酶；所述
dNTP
能够在
DNA
聚合酶的作用下进行第一环化产物和第二环化产物的滚环扩增，形成第一环状扩增产物和第二环状扩增产物
。4.
如权利要求1～3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述第一检测探针和第二检测探针上分别偶联有第一荧光标记物和第二荧光标记物；所述淬灭探针上偶联有荧光淬灭标记物；所述第一检测探针和第二检测探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互补配对；所述淬灭探针能够分别与第一锁式探针和第二锁式探针的反义链互...

【专利技术属性】
技术研发人员：李金泽，张琴琴，周连群，郭振，李传宇，李莹雪，姚佳，张威，李超，杨弃，张芷齐，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：