一种SCA亚型基因动态突变检测的引物对、试剂盒及方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，涉及一种SCA亚型基因动态突变检测的引物对、试剂盒及检测方法。具体公开了采用1+1扩增体系检测8个SCA亚型基因的动态突变区域重复数的技术方案；8个SCA亚型基因包括SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17。总之，本发明专利技术可有效检测SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17型基因的重复数，CAG重复数误差约为正负1个，并且对于少见的SCA7、SCA8高重复数样本不会漏检，具有很好的应用前景和市场价值。具有很好的应用前景和市场价值。具有很好的应用前景和市场价值。

【技术实现步骤摘要】
一种SCA亚型基因动态突变检测的引物对、试剂盒及方法


[0001]本申请属于分子生物学
，更具体地说，它涉及一种SCA亚型基因动态突变检测的引物对、试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]脊髓小脑共济失调(SCA)是一组表现为高度临床异质性和遗传异质性的常染色体显性遗传性神经系统疾病，主要表现为进行性加重的肢体共济失调，构音障碍、眼球运动障碍等。发病率约为5/10万，占神经系统遗传性疾病的10％
‑
15％。
[0003]SCA的发病分子基础主要是动态突变，即疾病基因中的CAG端串联重复序列拷贝数发生不稳定的持续扩增，使得其编码异常的含多聚谷氨酰胺的蛋白，最终导致细胞凋亡、神经元变性。正常人基因内的CAG三核苷酸重复由数次至数十次，当重复数超出正常范围时，则导致疾病表型出现。异常扩增的CAG重复数与发病年龄呈负相关，与病情严重程度也有一定关系，且在世代传递中不稳定，可进一步扩增，导致后代发病年龄提早，病情加重，即遗传早现现象。目前临床根据病史、体征、家族史、影像学特征进行疾病诊断，具体分型则需要进行基因检测。针对脊髓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非医疗目的的SCA亚型基因动态突变检测的方法，其特征在于，在SCA1、SCA2、SCA3、SCA6、SCA7、SCA8、SCA12、SCA17动态突变区域两侧设计扩增引物组，根据扩增产物长度及计算模型计算动态突变重复数；Primer Mix 1引物组反应体系包含但不限于以下4个组合，(1)SCA1、SCA8；(2)SCA2、SCA17；(3)SCA3、SCA12；(4)SCA6、SCA7，优先4个组合，每个引物对组合中的引物标记相同的荧光报告基团；每个引物对组合之间的荧光报告基团不同；根据动态突变重复数的范围需求，SCA1、SCA2、SCA3、SCA6扩增的产物大小与SCA8、SCA17、SCA12、SCA7扩增的产物大小形成差异以便于电泳结果区分，差异范围相距20～100bp，优先30～50bp。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步单独检测SCA 7、SCA8的体系，采用专门检测SCA7、SCA8高重复数突变的Primer Mix 2引物组合，引物组合中包含但不限于SCA7的扩增引物和SCA8的扩增引物，SCA7的延伸引物与SCA8的延伸引物；SCA7的引物和SCA8的引物修饰不同的荧光报告基团。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，荧光基团激发波长包含但不限于UV(300
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379nm)、Violet(380
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439nm)、Blue(440
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509nm)、Green/Yellow(510
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599nm)、Red(600
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729nm)、Near IR/IR(≥730nm)；荧光基团修饰引物不限于上游引物或下游引物中一种；SCA1、SCA2、SCA3、SCA6根据动态突变重复数的范围其产物大小包含但不限于100
‑
1000bp，优先100～600bp，而SCA8、SCA17、SCA12、SCA7的产物大小范围为大于600bp,优先不超过1200bp；优选：SCA1、SCA8的引物修饰FAM荧光报告基团；SCA2、SCA17的引物修饰HEX荧光报告基团；SCA3、SCA12的引物修饰ROX荧光报告基团；SCA6、SCA7的引物修饰TAM荧光报告基团。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Primer Mix 1引物组反应体系中引物比例：SCA1:SCA2:SCA3:SCA6:SCA7:SCA8:SCA12:SCA17＝1～2:1～2:1～2:1～2:2～4:2～4:2～4:2～4。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，Primer Mix 2引物对反应体系中引物比例：SCA7:SCA8＝1:1～3。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，Primer Mix 1引物组反应体系突变重复数计算方法基于各基因引物序列特定的重复数计算模型，如下SCA1：y＝2.9008x+233.22；SCA2:y＝3.0646x+98.4；SCA3:y＝3.0129x+265.73；SCA6:y＝3.1015x+680.61；SCA7:y＝2.8919x+245.38；SCA8:y＝3.0158x+616.13；SCA12:y＝3.0413x+711.58；SCA17:y＝2.8398x+531.59；x为重复数个数，y为产物大小，只要等位基因的重复数结果中至少一个超过正常阈值范围，则判定该等位基因为致病突变，否则为正常；进一步地，包含但不限于毛细管电泳法、Sanger测序法等获得结果，优先毛细管电泳法。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以Primer Mix 1引物组反应体系的重复数计算模型对SCA7、SCA8进行判读时，若只有一个重复数结果，且在正常重复数阈值内时，必须结合Primer Mix 2引物对反应体系得到的锯齿峰判断，若锯齿峰延伸得到的重复数仅到正常重复数阈值范围内，判定为正常重复数，该基因即为正常；若延伸得到的重复数超过正
常重复数阈值，则判定为异常重复数，该基因即为致病突变；利用Primer Mix 2引物对反应体系锯齿峰延伸得到重复数，SCA7锯齿峰第一个起峰位置具有5个重复数，后续每一个峰增加1个重复数，依次类推，SCA8锯齿峰第一个起峰位置具有14个重复数，后续每一个峰增加1个重复数，依次类推。8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件：94
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98℃2分钟，1个循环；94
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98℃10秒，56
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68℃30秒，68
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72℃1分20秒，共35个循环；68
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72℃5分钟，1个循环；最后4℃保存；优选地，94℃2分钟，1个循环；98℃10秒，62℃30秒，68℃1分20秒，共35个循环；68℃5分钟，1个循环；最后4℃保存。9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，Primer Mix1引物组反应体系试剂组成为2
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PCR Buffer、Primer Mix1、DNA聚合酶、PCR添加剂、NF
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H2O，Primer Mix2...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑国枭，颜丙霄，黄奕孜，夏金泽，沈洁，吴松，秦杨静，肖蓁蓁，边佳昕，陆利，肖锐，
申请(专利权)人：浙江博圣生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：