本发明专利技术提供一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒及引物，3对退火温度一致，目的条带大小相同的引物组合，可放在同一反应体系，能够准确检测出15中钩体血清型。选择LigL32基因作为检测对象，应用3对特异性引物，实现广泛检测致病性钩端螺旋体的目的。本发明专利技术提供了一种省时省力，特异性和敏感性优异，可广泛检测中国钩端螺旋体的PCR引物及试剂盒。本发明专利技术提供的引物和试剂盒，可用于钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中，建立并组装的广泛检测致病性钩端螺旋体病PCR方法特异性强，并且检测钩体浓度的灵敏度可达到1个钩体的DNA含量。
【技术实现步骤摘要】
一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒及引物
本专利技术提供一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒及引物，将3对引物放入同一反应体系，能够特异性的检测出15种标准株钩体，省时省力，检测的致病性钩体血清型广泛，属于生物
技术介绍
钩端螺旋体病（简称钩体病）是由致病性钩端螺旋体（简称钩体）引起的一种自然疫源性人畜共患病，危害了人们身体健康以及畜牧业的发展。钩端螺旋体拥有众多血清型，我国存在至少15种致病性钩体，分别为赖型（56601）、爪哇型（56602）、犬型（56603）、拜伦型（56604）、致热型（56605）、秋季型（56606）、澳洲型（56607）、波摩那型（56608）、临型（56609）、七日热型（56610）、巴叶赞型（56612）、塔拉索夫型（56613）、清水型（56615）、乌尔夫型（56635）和明尼型（56655），括号内为该种血清型的标准菌株。目前存在的常用钩体PCR检测引物及专利产品，如LipL-32242和公开号为CN103205502A、公开号为CN101935696A的中国专利都不能将以上所有的钩体血清型全部检测出，只能检测出某几种钩体的血清型，造成PCR检测的假阴性，上述技术方案无法广泛检测致病性钩端螺旋体，后果严重。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术公开一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒及引物；将3对退火温度一致、目的条带一致的PCR引物放在同一个反应体系，目的是提供一种省时省力，特异性和敏感性优异，可广泛检测致病性钩端螺旋体LigL32基因的PCR引物及试剂盒，可用于检测致病性钩端螺旋体病的早期诊断。本专利技术原理在于选择了钩端螺旋体LigL32基因作为检测对象，并针对不同血清型钩端螺旋体的LigL32基因设计了3对退火温度一致的PCR引物，增加检测的广泛性、特异性和敏感性。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种广泛检测致病性钩端螺旋体的PCR引物，所述引物如下：上游引物：5’-CAGGCGACGGAGACTTAG-3’；5’-CAGGCGACGGAGACTTAG-3’；5’-CGGGCGACGGAGATTTAG-3’；下游引物：5’-AGACTCTTCAGCAGCGATAG-3’；5’-AGATTCTTCGGCGGCGATAG-3’；5’-AGATTCTTCAGCTGCTATGG-3’。所述引物的扩增片段长度为468bp。本专利技术所述的一种广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：上述的PCR引物、阳性对照、阴性对照、Taq酶、dNTP、10×Buffer、ddH2O；具体如下：1）阳性对照20uL*1管；2）阴性对照20uL*1管；3）反应管23ul*8管。本专利技术所述的一种广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒制备方法，包括以下步骤：1）阳性对照的制备，培养56601钩体，提取108个钩体的DNA，用50ulTE缓冲液进行洗脱，检测核酸浓度，并用TE缓冲液稀释至1ng/uL，分装后-20℃保存；2）阴性对照的制备，将蒸馏水经0.22um滤膜过滤后，进行高压灭菌处理，分装后-20℃保存；3）反应管的制备，将3对引物、Taq酶、dNTP、10×Buffer和ddH2O混合均匀，其中每条引物的终浓度为0.5uM，Taq酶的体积比为1:50，dNTP的体积比为4:50，10×Buffer的体积比为1:10，加入ddH2O定容到4.6ml，分装后-20℃保存；4）提取待测样本的DNA，将2uL样本DNA加入反应管中；5）取阳性对照2uL于反应管中做为检测的阳性对照，同时取阴性对照2uL于反应管中做为检测的阴性对照；6）放入PCR仪，94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min；7）将产物进行1%的核酸凝胶电泳，110v，20min，用凝胶成像仪进行观察，目的条带大小为468bp。由于所述引物的扩增片段能够证明钩端螺旋体LigL32基因的存在，从而证明致病性钩端螺旋体的存在，因此，所述引物可用来制备广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒；使所述引物能够最大程度地增加反应成功率和反应效果。本专利技术的有益效果在于：本专利技术设计了3对退火温度一致，目的条带大小相同的引物组合，可放在同一反应体系，能够准确检测出15种钩体血清型。选择LigL32基因作为检测对象，应用3对特异性引物，实现广泛检测致病性钩端螺旋体的目的。本专利技术提供了一种省时省力，特异性和敏感性优异，可广泛检测钩端螺旋体的PCR引物及试剂盒。本专利技术提供的引物和试剂盒，可用于钩端螺旋体病的早期诊断在该实验中，建立并组装的广泛检测致病性钩端螺旋体病PCR方法特异性强，并且检测钩体浓度的灵敏度可达到1个钩体的DNA含量。附图说明图1为实施例1的PCR效果图；图2为实施例2的PCR效果图；（P.S:M表示为DNAmaker、1—15分别表示：钩端螺旋体标准菌株赖型56601，爪哇型56602，犬型56603，拜伦型56604，致热型56605，秋季型56606，澳洲型56607，波摩那型56608，临型56609，七日热型56610，巴叶赞型56612，塔拉索夫型56613，清水型56615，乌尔夫型56635，明尼型56655）图3为试验例1的PCR效果图；图4为试验例2的PCR效果图；（P.S:1—3分别为：阴性对照、大肠杆菌、非致病性钩端螺旋体）；图5为试验例3的PCR效果图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1、菌株和临床样本钩端螺旋体标准菌株赖型56601，爪哇型56602，犬型56603，拜伦型56604，致热型56605，秋季型56606，澳洲型56607，波摩那型56608，临型56609，七日热型56610，巴叶赞型56612，塔拉索夫型56613，清水型56615，乌尔夫型56635，明尼型56655，非致病性钩体566505，由课题所在实验室传代培养保存。2、主要仪器和试剂凝胶电泳图像分析系统（北京六一仪器厂，中国）；梯度PCR仪（BiometraUNO，德国）；CO2恒温培养箱（SANYO，日本），细菌基因组DNA提取试剂盒以及胶回收试剂盒购自天根公司；Taq酶、琼脂糖等常规试剂购自国产公司。实施例1引物设计与合成根据GenBank中已发表的钩体不同血清型的LigL32基因序列，应用PrimerPremier5.0软件设计得到不同的引物，经筛选得到本专利技术所述的3对退货温度一致的特异性引物。筛选得到的引物通过NCBI中的BLAST进行特异性鉴定，如表1所示。引物均由库美生物公司合成。上游引物：5’-CAGGCGACGGAGACTTAG-3’；5’-CAGGCGACGGAGACTTAG-3’；5’-CGGGCGACGGAGATTTAG-3’；下游引物：5’-AGACTCTT本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的PCR引物，其特征在于：所述引物如下：上游引物：5’‑ CAGGCGACGGAGACTTAG‑3’；5’‑ CAGGCGACGGAGACTTAG‑3’；5’‑ CGGGCGACGGAGATTTAG‑3’；下游引物：5’‑ AGACTCTTCAGCAGCGATAG ‑3’；5’‑ AGATTCTTCGGCGGCGATAG‑3’；5’‑ AGATTCTTCAGCTGCTATGG‑3’；上述3对PCR引物退火温度一致，目的条带大小一致，可放于同一反应体系中进行PCR反应。
【技术特征摘要】
1.一种可广泛检测致病性钩端螺旋体的PCR引物，其特征在于：所述引物如下：上游引物：5’-CAGGCGACGGAGACTTAG-3’；5’-CAGGCGACGGAGACTTAG-3’；5’-CGGGCGACGGAGATTTAG-3’；下游引物：5’-AGACTCTTCAGCAGCGATAG-3’；5’-AGATTCTTCGGCGGCGATAG-3’；5’-AGATTCTTCAGCTGCTATGG-3’；上述3对PCR引物退火温度一致，目的条带大小一致，可放于同一反应体系中进行PCR反应。2.一种广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的PCR引物、阳性对照、阴性对照、Taq酶、dNTP、10×Buffer、ddH2O，具体如下：1）阳性对照20uL*1管；2）阴性对照20uL*1管；3）反应管23ul*8管。3.根据权利要求2所述的一种广泛检测致病性钩端螺旋体的试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1）阳性对照的制备，培养56601钩体，提...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹永国，宋宁，张文龙，付云贺，谢旭峰，丁壮，张乃生，吴殿君，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林,22
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