一种沙门氏菌快速鉴定与分型方法及试剂盒技术

本发明专利技术涉及兽用生物制品与食品微生物技术领域，尤其是一种沙门氏菌快速鉴定与分型方法及试剂盒，利用多重PCR方法快速检测禽肉生产链样品或分离株菌液中的沙门氏菌，同时指明其中是否含有肯塔基血清型。一种沙门氏菌快速鉴定与分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，基于S.Kentucky 1C1的菌液制备得到PCR模板；步骤2，制备引物组，由stn‑F、stn‑R、gly‑F、gly‑R、bcf‑F、bcf‑R组成；步骤3，基于步骤1得到的PCR模板，利用步骤2得到的引物组建立多重PCR检测的反应体系，该多重PCR检测的反应体系在预定反应条件下得到PCR扩增产物；步骤4，对步骤3获得的扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果判定是否含有沙门氏菌。

【技术实现步骤摘要】
一种沙门氏菌快速鉴定与分型方法及试剂盒
本专利技术涉及兽用生物制品与食品微生物
，尤其是一种沙门氏菌快速鉴定与分型方法及试剂盒，主要用于动物及其产品产业链样品中沙门氏菌及其血清型肯塔基的多重PCR检测。
技术介绍
沙门氏菌是一种重要的人兽共患病原菌，主要寄居于人和动物的肠道中，研究表明由沙门氏菌引起的食物中毒是所有细菌性食物中毒中比例最高、危害最广的一种。世界卫生组织（WHO）调查表明全球每年有上亿例人类胃肠炎是由沙门氏菌感染引起，其中死亡病例高达300万。非伤寒沙门氏菌（nontyphoidalSalmonella，NTS）能够引起肠胃炎（食物中毒）、菌血症以及继发的病灶感染等，是威胁全球的公共卫生问题。据报道，我国细菌性肠胃炎的常见致病菌中，NTS仅次于副溶血弧菌，位居致病谱的第2位。大多数NTS的感染归因于食用了受污染的动物性食品，引发带有腹部绞痛的肠胃炎、高热及腹泻等胃肠炎症状，虽然大多预后良好，但是对于年老体弱者或者免疫力低下者，仍会有致命的危险。动物及动物产品产业中广泛存在着携带或污染沙门氏菌的情况，尤其是禽肉产业重，禽类食品是该类感染的重要载体。沙门氏菌是一种使宿主常呈现无明显症状的家禽肠道定植菌。应激或患病情况下的幼禽为沙门氏菌高频的水平传播提供了机会。来自美国USDA-FSIS数据显示每四块生鸡组织就非常可能出现1例沙门氏菌污染。不仅如此，优势的沙门血清型能传播到可再生组织，导致菌体和禽蛋相关沙门氏菌病的垂直传播。氟喹诺酮类和三代头孢类抗生素是目前治疗沙门氏菌感染的首选用药。由于上述两类药物在禽类养殖业中也被广泛应用，因此养鸡场和市售鸡肉已成为含超广谱β-内酰胺酶（extendedspectrumβ-lactamases，ESBLs）和喹诺酮耐药沙门氏菌的重要储存库。准确、快速、经济地检测常见且具有重要公共卫生意义的沙门氏菌血清型十分关键。肯塔基血清型沙门氏菌，最早鉴定于1937年，分离自养殖鸡体，考夫曼抗原式为8,20i:z6，该菌被公认为与禽类相关。肯塔基沙门氏菌流行于北非、欧洲、北美等地区，对环丙沙星及三代头孢菌素等抗生素呈现多重、高水平耐药，因此亦被欧美地区称为“超级耐药”肯塔基沙门氏菌。有流行病学证据证实“超级耐药”肯塔基沙门氏菌系通过旅游者从北非传播到欧洲和北美地区，因而欧洲和北美地区的食品及农业管理部门对其检出及传播高度关注，是上述地区非伤寒沙门氏菌重点监测的血清型之一。我国禽肉产业中四种沙门氏菌血清型是主要危害：肯塔基、肠炎、印第安纳、鸡白痢。肯塔基位列我国及美国等国家鸡肉产品中最常见血清型的前三位，并且也是零售禽肉产品中严重污染的菌株。该血清型中携带环丙沙星（CIP）耐性的序列型ST198菌株传播后可造成严重后果。传统食源性致病菌的检测方法通常需要花费很长时间，许多快速、灵敏的分子生物学方法已被应用于食品微生物的检测、鉴定，克服了传统检测方法的缺陷，其中聚合酶链式反应（polymerasechainreaction,PCR）已成为最普通的食品微生物分子生物学检测方法。近年来在PCR的基础上发展了多重PCR（multiplexPCR,MPCR）技术，它是一种在一个反应体系中加入多对引物同时检测多个目的片段的技术，可以为单一模板也可以是几种不同的模板，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR在食源性致病菌的检测上已得到较好的应用，可以同时检测一种致病菌的多个基因，也可以同时检测多种致病菌。传统的PCR方法多采用invA、fimH、stn基因设计引物，灵敏度往往较好，但常出现假阳性率或假阴性率高的现象，一重PCR方法本身的特异性也不能令人信服。目前没有面向整个动物及其产品产业链（包括市售肉类）样品中沙门氏菌及肯塔基血清型的检测方案。
技术实现思路
本专利技术的目的是设计沙门氏菌肠道种I型亚种的种属特异性引物及肯塔基血清型的血清型特异性引物，并且对PCR反应条件进行优化，建立同时扩增沙门氏菌多对基因的同一PCR反应条件。利用多重PCR方法快速检测禽肉生产链样品或分离株菌液中的沙门氏菌，同时指明其中是否含有肯塔基血清型。本专利技术的技术目的是这样实现的：一种沙门氏菌快速鉴定与分型的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：1)空白对照：ddH20；2)阳性参照品：S.Kentucky1C1的DNA，由试剂盒法或水煮法提取获得，作为PCR模板；3）引物组，由引物stn-F、stn-R、gly-F、gly-R、bcf-F、bcf-R组成；各引物的核苷酸序列分别为：stn-F：5′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′；stn-R：5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′；gly-F：5′-TTCCAATTGAAACGAGTGCGG-3′；gly-R:5′-ACTAACCGCTTGGGTTGTTGCTGT-3′；bcf-F：5′-GGGTGGGCGGAAAACTATTTC-3′；bcf-R:5′-CGGCACGGCGGAATAGAGCAC-3′；4）反应酶：2xM5TaqPCRMix；6）DNA分子量标准：DL2000DNAMarker；7）核酸染料；8）琼脂糖。所述水煮法包含以下步骤：涡旋振荡混匀S.Kentucky1C1的样品增菌液，取1ml于2mlEP管，13000rpm离心1.5min，弃上清，1ml双蒸水洗涤一遍，13000rpm离心1.5min，弃上清；加入70μl的双蒸水重悬，沸水煮30-35min，再立即冰浴5~10min，11000rpm离心3min，取上清液为PCR模板。所述PCR模板进行多重PCR检测的反应体系为：反应酶2xM5TaqPCRMix10μL；stn-F、stn-R引物各0.34μL，终浓度170nmol/L；gly-F、gly-R引物各0.48μL，终浓度240nmol/L；bcf-F、bcf-R引物各0.2μL，终浓度100nmol/L；PCR模板4μL，ddH203.96μL。所述PCR模板进行多重PCR检测的反应条件：95℃预变性5min；95℃变性25s，59.4℃退火25s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸8min。本专利技术的另一个技术方案：一种沙门氏菌快速鉴定与分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，基于S.Kentucky1C1的菌液制备得到PCR模板；步骤2，制备引物组，由stn-F、stn-R、gly-F、gly-R、bcf-F、bcf-R组成；各引物的核苷酸序列分别为：stn-F：5′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′；stn-R：5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′；gly-F：5′-TTCCAATTGAAACGAGTGCGG-3′；gly-R:5′-ACTAACCGCTTGGGTTGTTGCTGT-3′；bcf-F：5′-GGGTGGGCGGAAAACTATTTC-3′；bcf-R:5′-CGGCACGGCGGAATAGAGCAC-3′；步骤3，基于步骤1得到的PCR模板，利用步骤2得到的引物组建立多重PCR检测的反应体系，该多重PCR检测的反应体系在预定反应条件下得到PCR扩增产物；步骤4，对步骤3获得的扩增产物进行电泳检测，根据电泳检测结果本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种沙门氏菌快速鉴定与分型的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：1) 空白对照：dd H20；2) 阳性参照品：S. Kentucky 1C1的DNA，由试剂盒法或水煮法提取获得，作为PCR模板；3）引物组，由引物stn‑F、stn‑R、gly‑F、gly‑R、bcf‑F、bcf‑R组成；各引物的核苷酸序列分别为：stn‑F：5′‑CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG ‑3′；stn‑R：5′‑TGCCCAAAGCAGAGAGATTC ‑3′；gly‑F：5′‑TTCCAATTGAAACGAGTGCGG ‑3′；gly‑R: 5′‑ACTAACCGCTTGGGTTGTTGCTGT‑3′；bcf‑F：5′‑GGGTGGGCGGAAAACTATTTC ‑3′；bcf‑R: 5′‑CGGCACGGCGGAATAGAGCAC ‑3′；4）反应酶：2xM5 Taq PCR Mix；6）DNA分子量标准：DL2000 DNA Marker；7）核酸染料；8）琼脂糖。

【技术特征摘要】
1.一种沙门氏菌快速鉴定与分型的试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：1)空白对照：ddH20；2)阳性参照品：S.Kentucky1C1的DNA，由试剂盒法或水煮法提取获得，作为PCR模板；3）引物组，由引物stn-F、stn-R、gly-F、gly-R、bcf-F、bcf-R组成；各引物的核苷酸序列分别为：stn-F：5′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′；stn-R：5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′；gly-F：5′-TTCCAATTGAAACGAGTGCGG-3′；gly-R:5′-ACTAACCGCTTGGGTTGTTGCTGT-3′；bcf-F：5′-GGGTGGGCGGAAAACTATTTC-3′；bcf-R:5′-CGGCACGGCGGAATAGAGCAC-3′；4）反应酶：2xM5TaqPCRMix；6）DNA分子量标准：DL2000DNAMarker；7）核酸染料；8）琼脂糖。2.如权利要求1所述一种沙门氏菌快速鉴定与分型的试剂盒，其特征在于：所述水煮法包含以下步骤：涡旋振荡混匀S.Kentucky1C1的样品增菌液，取1ml于2mlEP管，13000rpm离心1.5min，弃上清，1ml双蒸水洗涤一遍，13000rpm离心1.5min，弃上清；加入70μl的双蒸水重悬，沸水煮30-35min，再立即冰浴5~10min，11000rpm离心3min，取上清液为PCR模板。3.如权利要求1或2所述一种沙门氏菌快速鉴定与分型的试剂盒，其特征在于：所述PCR模板进行多重PCR检测的反应体系为：反应酶2xM5TaqPCRMix10μL；stn-F、stn-R引物各0.34μL，终浓度170nmol/L；gly-F、gly-R引物各0.48μL，终浓度240nmol/L；bcf-F、bcf-R引物各0.2μL，终浓度100nmol/L；PCR模板4μL，ddH203.96μL。4.如权利要求3所述一种沙门氏菌快速鉴定与分型的试剂盒，其特征在于：所述PCR模板进行多重PCR检测的反应条件：95℃预变性5min；95℃变性25s，59.4℃退火25s，72℃延伸60s，循环35次；72℃延伸8min。5.一种沙门氏菌快速鉴定与分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，基于S.Kentucky1C1的菌液制备得到PCR模板；步骤2，制备引物组，由stn-F、stn-R、gly-F、gly-R、bcf-F、bcf-R组成；各引物的核苷酸序列分别为：stn-F：5′-CTTTGGTCGTAAAATAAGGCG-3′；stn-R：5′-TGCCCAAAGCAGAGAGATTC-3′；gly-F：5...

【专利技术属性】
技术研发人员：乐敏，方维焕，潘航，李芳，李渊，
申请(专利权)人：安徽九天英诺动物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34