一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒，属于分析检测领域。本发明专利技术是以发夹探针HP结合核酸外切酶Exo III辅助目标信号级联再循环扩增策略。以G‑quadruplex为信号报告分子，可现实免标记检测金黄色葡萄球菌mecA基因，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，简单、免标记，且灵敏度高，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。本发明专利技术所述的检测方法和检测试剂盒，对环境或食品中金黄色葡萄球菌的快速检测具有重要意义。

A Method and Kit for Detecting MecA Gene of Staphylococcus aureus by Label-free Fluorescence Detection

The invention discloses a label-free fluorescence method for detecting mecA gene of Staphylococcus aureus and a detection kit, which belongs to the field of analysis and detection. The present invention is a hairpin probe HP combined with exonuclease Exo III assisted target signal cascade recycling amplification strategy. Using G_quadruplex as signal reporter, the mecA gene of Staphylococcus aureus can be detected without labeling, which simplifies the operation and reduces the cost. The whole detection process responds quickly, is simple, label-free, and has high sensitivity. It can grasp the operation process without professional training, and is convenient for rapid popularization and use. The detection method and the detection kit of the invention have important significance for the rapid detection of Staphylococcus aureus in environment or food.

【技术实现步骤摘要】
一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒
本专利技术属于分析检测领域，具体涉及一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌mecA基因的方法及检测试剂盒。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是造成人和动物感染的最主要致病菌，普遍存在于环境和食品中。即使在低浓度下，金黄色葡萄球菌也可危及人与动物的生命健康，比如会引起急性肺炎、败血症、中毒性休克等疾病。目前，常规的金黄色葡萄球菌检测方法主要有微阵列，聚合酶链式反应，高通量测序和表面等离子共振等方法。这些方法需要对待测样品进行分离富集，操作繁琐和费时，不利于快速现场检测。近年来，利用生物传感器检测致病菌的方法备受关注，已建立荧光、电化学以及比色法等分析技术，但大多需要进行标记，因而限制了这些技术的广泛应用。因此，迫切需要构建一种新型检测技术用于金黄色葡萄球菌的检测，使检测过程具有快速、简单、免标记和灵敏度高等特点，从而降低成本，易于推广。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，利用发夹探针(HP)和核酸外切酶(ExoIII)辅助的目标信号级联循环扩增策略，构建了一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法及检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，包括发夹探针HP、缓冲溶液、N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)和核酸外切酶ExoIII，其中发夹探针HP既包含识别原件又包含信号报告原件。发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G-quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G-quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同，形成mecA基因类似物，而G-quadruplex序列充当信号报告因子；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因。本专利技术试剂盒中添加了ExoIII，为了防止发夹探针HP被酶切，所以需要在发夹探针HP的3'端连接数个保护性碱基，使其形成3'端突出末端，即IV区。IV区序列与mecA基因的部分序列互补配对。优选的，发夹探针HP中I区包含23-27个碱基，II区包含7-9个碱基，III区包含15-27个碱基，IV区包含9-13个碱基。优选的，发夹探针HP的I区序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA(SEQIDNO：1)。优选的，发夹探针HP的II区序列为：TAGCGTCAT(SEQIDNO：2)。优选的，I与III区序列完全互补。将G-quadruplex紧紧绑住，降低背景信号。优选的，发夹探针HP的III区序列为：TGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCC(SEQIDNO：3)。优选的，发夹探针HP的IV区序列为CTATGATCCCAAT(SEQIDNO：4)。优选的，发夹探针HP的序列如下所示：HP:5'-GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA(I区)-TAGCGTCAT(II区)-TGATCCCAATCCCAACCCGCCCTACCC(III区)-CTATGATCCCAAT(IV区)-3'(SEQIDNO：5)。优选的，缓冲溶液包括Tris-HCl缓冲溶液，pH＝7.0-7.5。优选的，缓冲溶液为20mMTris-HCl缓冲溶液，其中含有100mMNaCl，10mMMgCl2，15mMKCl，pH＝7.4。此处，缓冲溶液是模拟生理条件，有利于碱基配对。缓冲液的成分、种类和pH可以适应性调整。优选的，缓冲溶液还包括1×NEBuffer缓冲液，作为ExoIII酶切缓冲液。本专利技术的反应原理如下：当存在mecA基因时，发夹探针IV区与mecA基因通过碱基互补结合，使发夹探针HP的3’端IV区形成双链DNA的平末端。接着ExoIII从发夹探针HP的3’端逐渐酶切双链DNA，最后切至II区，释放出含有G-quadruplex、mecA基因类似物(I和II区)和mecA基因。随后mecA基因类似物的I和II区同样与发夹探针HP的IV区结合引发类似mecA基因的反应过程。最后，在mecA基因和mecA基因类似物的不断循环下，释放出大量的G-quadruplex。不断产生的G-quadruplex与荧光染料NMM结合(λex＝399nm，λem＝610nm；λex为激发光波长，λem为发射光波长峰值)，产生明显的荧光变化。根据释放的G-quadruplex/NMM复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm，λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。因为mecAgene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecAgene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。在最佳条件下，该方法的线性范围从10fM到10nM，检测限为2.4fM。该方法还对其他可能的干扰核酸表现出显著的选择性。牛奶实际样品分析金黄色葡萄球菌mecA基因的结果表明，该方法具有较好的精密度和准确度。一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的方法，包括以下步骤：(1)将发夹探针HP溶解于缓冲溶液中，90-95℃加热5-10分钟，冷却至室温；(2)将待测溶液加入到含有发夹探针HP和ExoIII的缓冲溶液，室温下反应；再加入N-甲基卟啉二丙酸IX荧光染料，室温下反应；在激发波长为399nm，发射波长为610nm的条件下，测定上述体系的荧光强度；根据释放的G-quadruplex/NMM复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm，λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。其中，发夹探针HP、缓冲体系、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶ExoIII如上述任一项所述。当mecA基因不存在时，体系的荧光强度没有变化；当有mecA基因存在时，体系中发夹探针HP与mecA基因结合导致该复合物被ExoIII酶切。在酶切的作用下，发夹探针HP释放出mecA基因和mecA基因类似物。释放的mecA基因和mecA基因类似物不断与发夹探针HP结合，持续释放出G-quadruplex。根据释放的G-quadruplex/NMM复合物浓度与荧光强度成线性关系(λex＝399nm,λem＝610nm)，从而达到检测金黄色葡萄球菌mecA基因的目的。因为mecAgene是金黄色葡萄球菌的一段致病基因，只存在于金黄色葡萄球菌中，所以可以通过检测mecAgene达到检测金黄色葡萄球菌的目的。本专利技术所述的检测方法的原理图见图1。本专利技术的有益效果是：本专利技术是以发夹探针HP结合核酸外切酶(ExoIII)辅助目标信号级联再循环扩增策略。以G-quadruplex为信号报告分子，可现实免标记检测金黄色葡萄球菌mecA基因，简化了操作，降低了成本。整个检测过程响应迅速，简单、免标记，且灵敏度高，无需专业训练即可掌握操作流程，便于快速推广使用。本专利技术所述的检测方法和检测试剂盒，对环境或食品中金黄色葡萄球菌的快速检测具有重要意义。附图说明图1为本专利技术所述的检测方法的原理图；图2为对不同浓度的金黄色葡萄球菌mecA基因检测的结果图；图3为特异性实验结果图。具体实施方式下面结合实本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于：包括发夹探针HP、缓冲溶液、N‑甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶Exo III；其中发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G‑quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G‑quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因。

【技术特征摘要】
1.一种免标记荧光检测金黄色葡萄球菌的检测试剂盒，其特征在于：包括发夹探针HP、缓冲溶液、N-甲基卟啉二丙酸IX和核酸外切酶ExoIII；其中发夹探针HP从5'端开始依次为I、II、III和IV区域，其中I区5'端为G-quadruplex序列；II区构成发夹探针茎环结构的环；I区中G-quadruplex序列以外的序列加上II区序列这一段区域与mecA基因序列相同；III区与I区完全互补，共同构成发夹探针茎环结构的茎；IV为3'端凸起，通过碱基互补识别mecA基因。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP中I区包含23-27个碱基，II区包含7-9个碱基，III区包含15-27个碱基，IV区包含9-13个碱基。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的I区序列为：GGGTAGGGCGGGTTGGGATTGGGATCA。4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于：发夹探针HP的II区序列为：TAGCGTCAT。5.根据权利要求2所述的检测试...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊华，李琼，潘家峰，周丹华，施晨露，潘苏红，
申请(专利权)人：广东省生态环境技术研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44