一种海洋可培养细菌PCR快速检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开一种适用于海洋可培养细菌PCR快速检测的方法及试剂盒，属于微生物检测技术领域。该试剂盒包括DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂；其中，DNA提取试剂为Chelex‑100；PCR反应试剂包括2条通用16S rRNA引物（27F和1492R）和2×Taq PCR Mastermix溶液；电泳试剂包括琼脂糖、50×TBE、Goldview II型核酸染料、DNA Marker。本试剂盒可在短时间内对海洋可培养细菌进行DNA扩增，步骤简单，并且安全、经济、高效，菌体需要量小。

【技术实现步骤摘要】
一种海洋可培养细菌PCR快速检测方法及试剂盒
本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及一种海洋可培养细菌快速PCR检测的方法及试剂盒。
技术介绍
由于陆生资源的研究趋于常态化，可利用材料越来越少，现有微生物分子生态学研究表明海洋中蕴藏大量微生物资源，这些微生物对地球物质循环、生态平衡和人类健康具有十分重要的意义，因此，更多的国内外研究者将注意力放在了海洋上。因海洋独特的环境赋予了海洋细菌新颖、特意和多样化的代谢活性物质，海洋细菌的研究越来越多。细菌的鉴定是微生物研究的重要内容，是分析其独特生理生化和代谢活性多样性等必要的研究手段。这里说的海洋可培养细菌指的是海水、沉积物中存在的和海洋动植物上的共生菌。目前，海洋细菌中常规的聚合酶链反应（PCR）检测中，通常采用的是SDS高盐提取法、碱性裂解法、酚、氯仿抽提法和溶菌酶法提取细菌DNA，这些传统的DNA提取方法步骤繁琐，费时费力，菌体需要量大，效果不理想。而本专利技术中DNA的提取采用的是Chelex-100法，该方法的优点是一步提取，是一种快速、高效、经济的DNA提取方法。而且现在还没有专门用于海洋细菌快速PCR的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对海洋可培养细菌，提供一种检测快速快、操作简单、成本低且灵敏度高的PCR检测方法及试剂盒。为实现本专利技术目的所使用的技术方案为：一种海洋细菌快速PCR试剂盒，包括DNA提取试剂、PCR反应试剂电泳试剂；其中：（1）DNA提取试剂：Chelex-100，浓度为10%（w/v）；（2）PCR反应试剂：16SrDNA通用引物、2×TaqPCRMastermix和ddH2O；其中，通用引物序列为现有技术中的27F和1492R，其序列分别为：27F：5ʹ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ʹ；1492R：5ʹ-GGTTACCTTGTTACGACTT-3ʹ。（3）电泳试剂：琼脂糖、50×TBE、GoldviewII型核酸染料、DNAMarker。一种用海洋可培养细菌PCR快速检测试剂盒的方法包括如下步骤：S1.海洋可培养细菌DNA的提取：移取100µL10%（w/v）无菌Chelex-100溶液至1.5mLEppendorf管中，用灭菌后的牙签挑取纯培养后的菌落，挑取米粒大小至管壁上碾碎分散并使Chelex-100溶液溶解混匀。沸水浴10min后冷却至室温后低速离心10min，上清液即为PCR模板，可于-20℃保持备用。扩增反应体系制备：取0.5mLPCR管依次加入以下溶液形成50µL反应体系：引物27F1µL，引物1492R1µL，2×TaqPCRMastermix25µL，ddH2O22µL，DNA模板1µL；S3.PCR反应参数设定：93-96℃变性、4-6min；92-95℃变性、0.5-2min；52-58℃复性、3-7min；70-75℃延伸、1-3min；70-75℃延伸、8-13min；共27-32个循环；本专利技术中PCR反应参数的设置，本申请专利技术人通过大量的创造性试验，获得使模板DNA和PCR产物的充分变性的条件，能够在提高产量的同时保持酶活性。通过反应体系中的基本组成及扩增引物的长度和浓度，本申请专利技术人依据海洋可培养细菌DNA的特性，提高退火温度和复性时间，与现有技术中的复性时间相比，反应时间长，以此增加扩增的特异性；本申请通过对延伸温度和时间的控制，不仅能够保持扩增产物的特异性，同时可保证产量。通过本申请设置的循环次数范围内，扩增DNA增加明显，可进一步增加产量时，同时避免增加非特异扩增。因此，本专利技术中的PCR反应参数是本专利技术人依据海洋可培养细菌DNA的特性，通过大量创造性试验获得的，可保证模板DNA的特异性反应的进行以及提高扩增DNA的产量。电泳检测：制备浓度为1%琼脂糖TBE凝胶，其中加入1µLGoldviewII型核酸染料，取2µLPCR产物上样，电压100V，电泳时间30min后，在260nm处凝胶成像分析系统观察。如果在1000bp处有清晰条带的，说明该样品PCR成功，可将样品扩增产物送测序公司进行测序。本申请中针对海洋可培养细菌的特性，本申请专利技术人选用16SrDNA通用引物作为引物，是基于：（1）16SrRNA普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18SrRNA）中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。（2）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。（3）16SrRNA的相对分子量大小适中，约1540个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。分离菌株16SrRNA基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞,加入100μL无菌重蒸H2O中,旋涡混匀后,沸水浴2min,12000rmin-1离心5min,上清液中即含16SrRNA基因，可直接用于PCR扩增。由于所设计的引物具有高度的选择特异性，在进行对海洋可培养细菌的检测时，要求引物所针对的靶序列位点应当相当保守，这样所建立的反应体系才具有普遍的适用性。研究中也可以设计一些兼并引物以增强应用的广泛性，但兼并度过高的引物会对扩增造成负面影响，本申请使用的16SrDNA通用引物克服了上述问题，对于海洋可培养细菌的快速检测具有广泛适用性，可广泛适用于一般细菌菌种的鉴定与系统发生学研究。本专利技术中，使用的Chelex-100是一种由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成的化学螯合树脂，可以高度选择性结合多价阳离子。细胞在100℃条件或碱性环境下破裂，DNA变性并释放出来，而Chelex可特异性吸附溶液中干扰离子并有效防止煮沸过程和金属离子对DNA的降解作用，之后即可通过离心作用除去溶液中Chelex颗粒，使DNA从结合物中分离出来。Chelex-100法提取DNA不仅简单易行，能缩短提取时间，而且极大的减小了DNA分子的损失，获取率比传统使用酚或氯仿提取法高，对样品的需要量小；并且因为操作步骤的简易，减少了样品在转移抽提等步骤中的所受污染，适用于绝大多数高精度、样品量少的DNA提取。本申请独创性的将Chelex-100试剂应用到海洋可培养细菌的检测当中，并且Chelex-100试剂能够结合多种可能影响下一步分析测试的海洋可培养细菌中的其他外源物质，并能通过结合金属离子，防止DNA降解。在扩增条件的选择中，考虑到海洋细菌所处的特殊环境（低温、高盐），设定的预变性95℃5min；变性温度是模板DNA双链解离的关键温度，温度过高会对降低酶的活性，过低解链不完全，1min的94℃变性温度可以保证DNA完全解链且有较高TaqDNA酶活性；根据引物27F和1492R的序列特点（20个核苷酸，G+C含量约为50%），55℃的退火温度可以减少引物和模板DNA的非特异性结合，提高聚合酶链特异性反应，退火时间延长至5min保证引物与模板之间完全结合；PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合，细菌的目标DNA片段为1500bp，延伸1.5min足够合成“半保留复制链”并成为下次循环本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种海洋可培养细菌快速PCR的试剂盒，其特征在于，包括：海洋细菌DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂，其中，（1）海洋细菌DNA提取样品制备及提取试剂浓度：海洋可培养细菌经海水培养基纯培养后的菌落、10%（w/v）无菌Chelex‑100溶液；（2）PCR反应试剂中各原料及其浓度：16S rDNA通用引物27F和1492R、10×PCRBuffe、5U/ Taq酶、10Mm dNTP和ddH2O；（3）电泳试剂：琼脂糖、50×TBE、Goldview II型核酸染料、DNA Marker。

【技术特征摘要】
1.一种海洋可培养细菌快速PCR的试剂盒，其特征在于，包括：海洋细菌DNA提取试剂、PCR反应试剂、电泳试剂，其中，（1）海洋细菌DNA提取样品制备及提取试剂浓度：海洋可培养细菌经海水培养基纯培养后的菌落、10%（w/v）无菌Chelex-100溶液；（2）PCR反应试剂中各原料及其浓度：16SrDNA通用引物27F和1492R、10×PCRBuffe、5U/Taq酶、10MmdNTP和ddH2O；（3）电泳试剂：琼脂糖、50×TBE、GoldviewII型核酸染料、DNAMarker。2.一种根据权利要求1所述的海洋可培养细菌PCR快速检测的试剂盒快速PCR的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.海洋可培养细菌DNA的提取：移取100µL10%（w/v）无菌Chelex-100溶液至1.5mLEppendorf管中，用灭菌后的牙签挑取纯培养后的菌落，挑取米粒大小至管壁上碾碎分散并使...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨小梅，谷毅鹏，段振华，伍淑婕，陈伟玲，
申请(专利权)人：贺州学院，
类型：发明
国别省市：广西,45